ogólne zasady transgenezy
organizmy transgeniczne zawierają obce DNA, które zostało wprowadzone przy użyciu biotechnologii. Obcego DNA (transgenu) definiuje się tutaj jako DNA z innego gatunku, lub rekombinowane DNA z tego samego gatunku, które zostało poddane manipulacji w laboratorium, a następnie ponownie wprowadzone. Terminy organizm transgeniczny i organizm zmodyfikowany genetycznie (GMO) są ogólnie synonimami., Proces tworzenia transgenicznych organizmów lub komórek, które mają być całymi organizmami z trwałą zmianą ich linii zarodkowej, nazywany jest albo transformacją, albo transfekcją. (Niestety, oba słowa mają alternatywne znaczenia. Transformacja odnosi się również do procesu przekształcania się komórek ssaków w nowotworowe, podczas gdy transfekcja odnosi się również do procesu wprowadzania DNA do komórek w hodowli, zarówno bakteryjnych, jak i eukariotycznych, do tymczasowego użycia, a nie do zmian linii zarodkowej.) Organizmy transgeniczne są ważnymi narzędziami badawczymi i są często używane podczas badania funkcji genu., Transgeneza jest również związana z praktyką medyczną terapii genowej, w której DNA jest przenoszone do komórek pacjenta w celu leczenia choroby. Organizmy transgeniczne są szeroko rozpowszechnione w rolnictwie. Około 90% rzepaku, bawełny, kukurydzy, soi i buraków cukrowych uprawianych w Ameryce Północnej są transgeniczne. Brak innych zwierząt transgenicznych lub roślin uprawnych (z wyjątkiem niektórych squash, papaya i Lucerna) są obecnie produkowane w Ameryce Północnej.
aby stworzyć transgeniczną komórkę, DNA musi najpierw zostać przeniesione przez błonę komórkową (i, jeśli jest obecne, przez ścianę komórkową), bez niszczenia komórki., W niektórych przypadkach nagie DNA (czyli plazmid lub DNA liniowe, które nie jest związane z żadnym rodzajem nośnika) może zostać przeniesione do komórki przez dodanie DNA do podłoża i czasowe zwiększenie porowatości błony, na przykład przez elektroporację. Podczas pracy z większymi komórkami, nagie DNA może być również mikroinjected do komórki za pomocą wyspecjalizowanej igły. Inne metody wykorzystują wektory do transportu DNA przez membranę. Zauważ, że użyte tu słowo „wektor” odnosi się do każdego rodzaju nośnika, a nie tylko wektorów plazmidowych., Wektory do transformacji / transfekcji obejmują pęcherzyki wykonane z lipidów lub innych polimerów, które otaczają DNA; różne rodzaje cząstek, które przenoszą DNA na swojej powierzchni; oraz zakaźne wirusy i bakterie, które naturalnie przenoszą własne DNA do komórki gospodarza, ale które zostały zaprojektowane tak, aby przenieść dowolną cząsteczkę DNA interesującą. Zazwyczaj obce DNA jest kompletną jednostką ekspresji, która zawiera własne regulatory cis (np. promotor), jak również gen, który ma być transkrybowany.
gdy celem eksperymentu jest wytworzenie stabilnej (tj., dziedziczny) transgeniczny eukaryot, obce DNA musi być włączone do chromosomów gospodarza. Aby tak się stało, obce DNA musi wejść do jądra gospodarza i rekombinować z jedną z chromatyd gospodarza. U niektórych gatunków obce DNA jest wstawiane w przypadkowym miejscu w chromatydzie, prawdopodobnie tam, gdzie dochodzi do złamania nici i nie homologicznego łączenia się końców. U innych gatunków obce DNA może być skierowane do konkretnego locus, poprzez flankowanie obcego DNA z DNA, które jest homologiczne do DNA gospodarza w tym locus., Obce DNA jest następnie włączane do chromosomów gospodarza poprzez rekombinację homologiczną.
Ponadto, aby wytworzyć organizmy wielokomórkowe, w których wszystkie komórki są transgeniczne, a transgen jest stabilnie dziedziczony, komórka, która została pierwotnie przekształcona, musi być gametą lub musi rozwinąć się w tkanki, które produkują gamety. Gamety transgeniczne mogą być łączone w celu wytworzenia homozygotycznego, transgenicznego potomstwa., Obecność transgenu u potomstwa jest zazwyczaj potwierdzana za pomocą PCR lub Southern blot, a ekspresja transgenu może być mierzona za pomocą odwrotnej transkrypcji PCR (RT-PCR), RNA blot i Western (protein blot).
szybkość transkrypcji transgenu jest w dużym stopniu zależna od stanu chromatyny, do której jest wstawiany (tj. efektów pozycyjnych), a także innych czynników. Dlatego badacze często generują kilka niezależnie przekształconych / przetransferowanych linii o tym samym transgenie, a następnie sprawdzają linie o najwyższej ekspresji., Dobrą praktyką jest również klonowanie i sekwencjonowanie transgenicznego locus z nowo wygenerowanego organizmu transgenicznego, ponieważ błędy (okrojenia, zmiany układu i inne mutacje) mogą być wprowadzane podczas transformacji/transfekcji.
Dodaj komentarz