Ewolucja mitochondrialnych genomów głębinowych Gulpera węgorza: wielkoskalowe zmiany genów powstały w obrębie węgorzy

Streszczenie

ostatnie badania wykazały, że odchylenia od typowego rzędu mitochondrialnych kręgowców są częstsze niż początkowo sądzono., Takie odchylenia są jednak niewielkie, z inwersjami i / lub translokacjami kilku genów zaangażowanych i tandemową duplikacją regionów genów, a następnie delecjami genów wywoływanymi jako mechanizmy pochodzące z takiego nowego rzędu genów., W trakcie molekularnych badań filogenetycznych Elopomorpha (węgorze i ich sprzymierzeńcy) odkryliśmy, że genomy mitochondrialne (mitogenomy) z dwóch węgorzy głębinowych, eurypharynx pelecanoides (Eurypharyngidae) i Saccopharynx lavenbergi (Saccopharyngidae), wykazują identyczny rząd genów, który znacznie różni się od innych kręgowców. Analiza filogenetyczna z wykorzystaniem danych mitogenomicznych z 59 gatunków ryb nie tylko potwierdziła pojedyncze pochodzenie takiego rzędu genów z pewnością, ale także wskazała, że został on wyprowadzony z typowego rzędu genów kręgowców., Szczegółowe porównania kolejności genów węgorza gulpera z typowymi kręgowcami sugerowały, że występowanie pojedynczego kroku, wielkoskalowej duplikacji regionu genowego rozciągającego się >12 kb, a następnie delecji genów u wspólnego przodka obu gatunków, najbardziej parsymonicznie tłumaczy ten niezwykły układ genów.

wprowadzenie

Vertebrate mitochondrial genów kolejność była początkowo uważana za konserwatywną, ponieważ kompletne sekwencje nukleotydów mitochondrialnych genomów (mitogenomów) od ssaków (Anderson et al. 1981, 1982; Bibb et al., 1981) i Afrykańska żaba szponiasta (Roe et al. 1985) wykazał wspólny porządek genów. Ponieważ kompletna Sekwencja mitochondrialnego DNA (mtDNA) została określona dla wielu kręgowców (269 gatunków na dzień 11 czerwca 2003 r.; strona internetowa National Center for Biotechnology Information: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PMGifs/Genomes/7742.html), uznano, że odchylenia od typowej kolejności genów nie są tak rzadkie u kręgowców (rys. 1; Boore 1999). Z wyjątkiem ssaków łożyskowych, przykłady obejmują wszystkie główne linie kręgowców, takich jak lampreys (Lee and Kocher 1995), Płazy (Macey et al. 1997; Sumida et al., 2001), Gady (Kumazawa and Nishida 1995; Quinn and Mindell 1996; Macey et al. 1997), ptaki (Desjardins and Morais 1990, 1991; Quinn and Wilson 1993; Mindell, Sorenson, and Dimcheff 1998), torbacze (Pääbo et al. 1991; Janke et al. 1994), i ryby (Miya i Nishida 1999; Inoue et al. 2001b; Miya, Kawaguchi, and Nishida 2001). Takie zmiany genów są jednak lokalne (zwłaszcza w obrębie klastra genów tRNA) i nie znaleziono żadnego przykładu, który obejmuje zmiany w skali genomowej.,

węgorze Gulpera są dobrze znanymi stworzeniami głębinowymi, łącznie z czterema rodzinami umieszczonymi w rzędzie Saccopharyngiformes, które występują na głębokościach bathypelagic (>1000 m) w oceanach świata (Bertelsen, Nielsen, and Smith 1989). Ich dziwaczny wygląd(rys. 1), co wynika z niezwykle powiększonych, zdeformowanych gapów na czubku głowy i ciała węża węgorza, przyciąga wiele uwagi od wielu badaczy (np Bertelsen, Nielsen, and Smith 1989; Robins 1989)., Takie wyspecjalizowane cechy anatomiczne doprowadziły badaczy do przypuszczenia, że pozycja filogenetyczna tych zwierząt znajduje się poza rybami kostnymi (np. Tchernavin 1946), chociaż ogólnie uważano je za bliskich krewnych prawdziwych węgorzy (rząd Anguilliformes), ponieważ mają one podobne do liści stadium larwalne leptocefaliczne (Greenwood et al. 1966; Inoue i Miya 2001).,

w trakcie molekularnych badań filogenetycznych Elopomorpha (węgorze i ich sprzymierzeńcy) na podstawie danych mitogenomicznych, znaleźliśmy niezwykły mitochondrialny rząd genów dla jednego z węgorzy gulpera, Eurypharynx pelecanoides (rys. 1). Artykuł opisuje nowatorską organizację genów w mitogenomach dwóch gatunków węgorzowatych: E. pelecanoides i Saccopharynx lavenbergi. Zastosowaliśmy metodę reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) opracowaną przez Miyę i Nishidę (1999) do sekwencjonowania kompletnych mitogenomów tych ryb., Aby zbadać pochodzenie tak unikalnych mitogenomów, poddaliśmy dane mitogenomiczne analizie filogenetycznej i omawiamy tutaj możliwe mechanizmy generujące taki układ genów w dwóch węgorzach.

materiały i metody

okazy

sekwencje mitochondrialnego DNA uzyskano od sześciu osobników z dwóch gatunków reprezentujących dwie rodziny z rzędu Saccopharyngiformes (Robins 1989). Dla monotypowej rodziny Eurypharyngidae jeden osobnik E., pelecanoides został użyty jako okaz do określenia pełnej sekwencji mtDNA, a pozostałe cztery osobniki, w tym dwie larwy leptocefaliczne, zostały użyte do określenia częściowych sekwencji czterech głównych węzłów genowych (rys. 2) w celu potwierdzenia kolejności genów w mitogenomie E. pelecanoides. W przypadku rodziny Saccopharyngidae pojedynczy osobnik S. lavenbergi został użyty jako okaz do określenia pełnej sekwencji mtDNA., Okazy bonów zdeponowano w zbiorach ryb w Muzeum Historii Naturalnej & Institute, Chiba, Japonia (CBM-ZF), oraz na Uniwersytecie w Waszyngtonie (UW): E. pelecanoides (CBM-ZF 10311: Hyuga-Nada, Południowa Japonia; CBM-ZF 10312, 10313, 10316 i 10317: equatorial central Pacific Ocean) i S. lavenbergi (uw 045633: Wschodni Pacyfik).

ekstrakcja DNA

część mięśni epaxialnych (ok. 0,25 g) wycięto ze świeżych okazów każdego gatunku i natychmiast zakonserwowano w 99,5% etanolu., Całkowity genomowy DNA ekstrahowano przy użyciu QIAGEN QIAamp tissue kit zgodnie z protokołem producenta.

Reakcja łańcuchowa polimerazy i sekwencjonowanie

całe mitogenomy dwóch węgorzy gulpera zostały wzmocnione za pomocą techniki long-PCR (Cheng, Higuchi, and Stoneking 1994). Pięć ryb-uniwersalnych i trzy specyficzne dla gatunku-podkładów long-PCR (S-LA-16S-L + H12293-Leu i L12321-Leu + S-LA-16S-h dla E. pelecanoides; l2508-16s + Sala-ND4-H i Sala-CO1-L + Sala-ND1-H dla S. lavenbergi; rys. 1) zostały wykorzystane do wzmocnienia całego mitogenomu każdego węgorza w dwóch reakcjach., Całe mitogenomy pozostałych czterech osobników E. pelecanoides zostały wzmocnione trzema rybami-uniwersalnymi podkładkami i jednym specyficznym gatunkowo long-PCR primer (L2508-16s + Eupe-ND2-H I L12321-Leu + S-LA-16S-H). Cztery specyficzne dla gatunku podkłady (Eupe-ND2-H Dla E. pelecanoides; Sala-CO1-L, Sala-ND1-H i Sala-ND4-H dla S. lavenbergi) zostały alternatywnie zaprojektowane w odniesieniu do częściowych sekwencji nukleotydów z genu ND2 E. pelecanoides oraz genów coi, ND1 i ND4 S. lavenbergi oznaczonych z każdego całkowitego DNA przy użyciu uniwersalnych podkładów fish.,

produkty long-PCR rozcieńczono buforem TE (1:20) w celu późniejszego wykorzystania jako szablony PCR, z wyjątkiem regionu interweniującego między dwoma Long-PCR primers (pomiędzy S-LA-16S-H I S-LA-16S-L oraz H12293-Leu i L12321-Leu dla E. pelecanoides; rys. 1), w którym alternatywnie zastosowano całkowite genomowe DNA.

w sumie 82 ryb-uniwersalne podkłady (Miya i Nishida 1999, 2000; Inoue et al., 2000, 2001a, 2001B, 2001c, 2001d; Ishiguro, Miya, and Nishida 2001; Kawaguchi, Miya, and Nishida 2001) były używane w różnych kombinacjach w celu wzmocnienia przylegających, nakładających się segmentów całego mitogenomu dla każdego z dwóch gatunków. Podkłady specyficzne dla danego gatunku zostały zaprojektowane w przypadkach, gdy nie były dostępne odpowiednie podkłady uniwersalne dla ryb. Lista primerów PCR stosowanych w odniesieniu do określonego gatunku jest dostępna w J. G. I. na życzenie. Long-PCR i kolejne reakcje PCR przeprowadzono jak wcześniej opisano (na przykład, Miya and Nishida 1999; Inoue et al. 2003).,

dwuniciowe produkty PCR, oczyszczone za pomocą zestawu Pre-sekwencjonowania (USB), były następnie wykorzystywane do bezpośredniego sekwencjonowania cyklu przy użyciu Terminatorów znakowanych barwnikiem (Applied Biosystems). Zastosowane podkłady były takie same jak w przypadku PCR. Wszystkie reakcje sekwencjonowania przeprowadzono zgodnie z instrukcjami producenta. Oznakowane fragmenty analizowano za pomocą sekwencera DNA Model 377 (Applied Biosystems).

analiza sekwencji

sekwencje DNA zostały przeanalizowane przy użyciu pakietu oprogramowania komputerowego DNASIS w wersji 3.2 (Hitachi Software Engineering)., Lokalizacje 13 genów kodujących białka zostały określone przez porównania sekwencji DNA lub aminokwasów mitogenomów ryb kostnych. 22 geny tRNA zostały zidentyfikowane na podstawie drugorzędowych struktur koniczyny (Kumazawa i Nishida 1993) oraz sekwencji anticodon. Dwa geny rRNA zostały zidentyfikowane na podstawie podobieństwa sekwencji i struktury wtórnej (Gutell, Gray, and Schnare 1993). Dane sekwencji są dostępne z DDBJ / EMBL / GenBank o numerach akcesyjnych AB046473 i AB046475-AB046490 dla E. pelecanoides i AB047825 dla S. lavenbergi.,

analiza filogenetyczna

Macierze danych z Inoue et al. (2001d) oraz Miya, Kawaguchi i Nishida (2001) zostały połączone i wyeliminowane zbędne taksony. Dodano sekwencje mitogenomiczne z dwóch węgorzy gulpera i dwóch teleostów (Gymnothorax kidako, AP002976 i Salmo salar, U12143). Ponieważ jednoznaczne wyrównanie dwóch genów rRNA na podstawie wtórnych modeli struktury nie było możliwe (Miya and Nishida 2000), nie zostały one wykorzystane w analizach., Gen ND6 nie był używany w analizach filogenetycznych ze względu na jego niejednorodny skład bazowy i konsekwentnie słabą wydajność filogenetyczną (np. Zardoya and Meyer 1996; Miya and Nishida 2000). Z analiz wykluczono również pętle tRNA, tRNASer (AGY) (niestabilne wnioskowane struktury drugorzędowe u niektórych gatunków) oraz inne niejednoznacznie wyrównane regiony, takie jak końce 5′ I 3′ kilku genów kodujących białka., Ponadto z analiz wykluczono 3. pozycje kodonów w genach kodujących białka, które mogły pozytywnie wprowadzić w błąd analizę związków wyższych poziomów actinopterygianów (Miya and Nishida 2000), pozostawiając 7984 dostępne pozycje nukleotydów z 12 genów kodujących białka i 21 genów tRNA.

bayesowskie analizy filogenetyczne przeprowadzono przy użyciu MrBayes 2.01 (Huelsenbeck and Ronquist 2001)., Jako najlepiej dopasowany model substytucji nukleotydów (ModelTest w wersji 3.06; Posada and Crandall 1998) wybrano ogólny model odwracalny w czasie, w którym niektóre miejsca są niezmienne i zmienne, w których przyjmuje się dyskretny rozkład gamma (GTR + i + Γ; Yang 1994). W MrBayes ustawiamy maksymalne parametry prawdopodobieństwa w następujący sposób: „lset nst = 6″ (GTR),” rates = invgamma „(i + Γ) oraz” basefreq = estymate ” (szacowany udział typów bazowych z danych). Łańcuch Markowa został tak ustawiony, że cztery łańcuchy (trzy ogrzewane i jeden zimny) biegły jednocześnie., Przeprowadziliśmy dwa niezależne biegi na 1 milion pokoleń, przy czym co 100 pokoleń próbkowano drzewa, z których każdy zaczynał się od przypadkowego drzewa. Dwie niezależne analizy zbiegły się na podobnych wynikach logopedycznych i osiągnęły „stacjonarność” (brak poprawy wyników ML) nie później niż 120 000 pokoleń., Tak więc pierwsze 1200 drzew zostało odrzuconych z każdej analizy, a pozostałe 17 602 połączone próbki z dwóch niezależnych analiz zostały wykorzystane do wygenerowania drzewa konsensusu opartego na zasadzie większości 50%, przy czym odsetek próbek odzyskujących konkretny Klad reprezentuje prawdopodobieństwo tego kladu (Huelsenbeck and Ronquist 2001).

wyniki

organizacje genomu

całkowita długość mitogenomów E. pelecanoides i S. lavenbergi wynosi 18 978 bp i 18 495 bp (z wyjątkiem części przypuszczalnego regionu kontrolnego dla S., lavenbergi), odpowiednio (zobacz Materiały uzupełniające w Internecie). Zawartość genomu tych dwóch węgorzy gulper zawiera dwa geny rRNA, 22 tRNA i 13 kodujących białka, jak stwierdzono u innych kręgowców (rys. 2). Podobnie jak u innych kręgowców, większość genów tych dwóch gatunków zakodowana jest na nici H, z wyjątkiem genów ND6 i ośmiu tRNA. Wszystkie cechy są podobne pod względem długości do tych u innych ryb kostnych, z wyjątkiem genu COI i regionu kontrolnego dla E. pelecanoides oraz genów coi i cyt b Dla S., lavenbergi (odpowiednio około 100, 800, 150 i 30 bp dłuższe niż u innych ryb kostnoszkieletowych).

mitogenom E. pelecanoides zawiera trzy regiony niekodujące dłuższe niż 200 bp (rys. 2; Zobacz także dodatkowe materiały online; region niekodujący i region kontrolny). Nc1, znajdujący się pomiędzy genami trnaasp(UCN) i tRNAAsp, oraz nc2, znajdujący się między genami tRNAAsp i COII, zawierają odpowiednio dwa i cztery pseudogeny odpowiadające degeneracyjnym kopiom genu tRNAAsp., Region noncoding (1,818 bp) położony pomiędzy genami cyt b i tRNAPhe wydaje się odpowiadać regionowi kontrolnemu. Mitogenom S. lavenbergi zawiera również trzy regiony niekodujące dłuższe niż 200 bp (region niekodujący i regiony kontrolne). Nc, znajdujący się pomiędzy genami tRNALeu(CUN) i ND5, zawiera co najmniej dwa pseudogeny odpowiadające degeneracyjnym kopiom genu tRNALeu(cun)., CR1 (992 bp), Znajduje się między dwoma klastrami genów tRNA (regiony TP i IM) i CR2 (> 837 bp), Znajduje się między genami cyt b i tRNAPhe, wydają się odpowiadać regionowi kontroli i mają całkowicie identyczne sekwencje ponad 800 bp, co wskazuje, że przechodzą one wspólną ewolucję (Patrz Kumazawa et al. 1998).

z wyjątkiem dwóch zduplikowanych regionów kontrolnych (CR1 i CR2) w Mitogenomie S. lavenbergi, mitogenomy z dwóch głębinowych węgorzy gulper wykazują identyczną kolejność genów (rys. 2)., Jednak kolejność genów mitochondrialnych obu węgorzy gulper znacznie różni się od wszystkich innych kręgowców znanych do tej pory. Kiedy niektóre geny tRNA zostały wyłączone z porównań (rys. 2), zidentyfikowaliśmy pięć bloków genów (a, tRNAGlu-tRNAGln; B, ATP8-ND3; C, tRNALeu (CUN)–ND6; D, tRNAIle–tRNALys; i E, trnaarg-tRNASer(AGY) regiony genów), których kolejność genów jest identyczna z typowymi kręgowcami.,

pozycje filogenetyczne dwóch węgorzy Gulpera

Rysunek 3 stanowi 50% drzewa konsensusu większości z 17 602 połączonych próbek z dwóch niezależnych bayesowskich analiz 59 sekwencji mitochondrialnych nukleotydów pochodzących ze skonkatenowanych 12 kodowań białkowych (brak 3 pozycji kodonów), plus 21 genów tRNA (tylko regiony macierzyste) przy użyciu modelu ewolucji sekwencji GTR + i + Γ (Yang 1994). Z wyjątkiem kilku węzłów w obrębie Neoteleostei, większość gałęzi wewnętrznych była poparta wysokim Bayesowskim prawdopodobieństwem tylnym (≥95%)., Należy zauważyć, że drzewo wynikowe wyraźnie pokazuje nie tylko, że dwa węgorze gulpera tworzą pokrewieństwo siostrzane z dużym prawdopodobieństwem (100%), ale także, że są głęboko zagnieżdżone w obrębie Węgorzokształtnych (anguilliformes), silnie sugerując, że pochodzą one od przodka podobnego do węgorza.

dyskusja

ostatnio ustalono ponad 140 kompletnych sekwencji mtDNA z ryb actinopterygian (np. Miya and Nishida 1999, 2000; Inoue et al., 2000, 2001a, 2001B, 2001c, 2001d, 2003; Ishiguro, Miya, and Nishida 2001, 2003; Kawaguchi, Miya, and Nishida 2001; Miya, Kawaguchi, and Nishida 2001; Miya et al. 2003; Saitoh et al. 2003), a kilka przykładów rearanżacji genów odnotowano (rys. 1). Należy zauważyć, że takie zmiany układu genów obejmują niewiele genów i że układ genów mitogenomów węgorza gulpera znacznie różni się od układu innych kręgowców.,

wpływ Filogenetyczny na pochodzenie nowego porządku genów

aby wydedukować ewolucję układu genów w dwóch węgorzach gulpera, wymagane jest wnioskowanie o organizacji przodków w oparciu o wiarygodne ramy filogenetyczne. Chociaż węgorze gulpera zostały włączone do Elopomorpha w oparciu wyłącznie o odrębną pelagiczną formę larwalną, określaną jako leptocephalus, nikt nie potwierdził ich pozycji filogenetycznej za pomocą matryc postaci pochodzących z danych morfologicznych lub molekularnych (Inoue and Miya 2001).,

Analiza bayesowska z wykorzystaniem danych mitogenomicznych z 59 gatunków, które w pełni reprezentują różnorodność ryb teleosteańskich (rys. 3) nie tylko potwierdziło, że nowy porządek genowy dwóch węgorzy gulper pochodzi od wspólnego przodka dwóch gatunków, ale także wykazało, że ich pochodzenie było niezależne od innych nowych rzędów genów. Wydaje się również, że nowy rząd genów Congera myriastera, innego członka Elopomorpha, ma pochodzenie niezależne od pochodzenia węgorzy gulpera., Należy zauważyć, że Anguilla japonica, która ma typowy rząd genów kręgowców, została z pewnością umieszczona jako gatunek siostrzany dwóch węgorzowatych. Najbardziej parsymoniczna rekonstrukcja zmian w układzie genów na drzewie filogenetycznym wskazywała, że nieprawidłowy rząd genów dwóch węgorzowatych pochodzi od typowych kręgowców.

możliwy mechanizm przegrupowania genów u węgorzy Gulpera

zaproponowano dwa główne mechanizmy wyjaśniające przegrupowania genów w mitogenomach kręgowców (Lee and Kocher 1995; Kumazawa et al. 1996)., Jednym z nich jest tandemowe duplikowanie regionów genów w wyniku nieprawidłowego parowania nici, a następnie delecje genów (Moritz and Brown 1986; Levinson and Gutman 1987). Chociaż dynamika układów genów mitochondrialnych nie zostały wyjaśnione w niektórych bezkręgowców (np Kurabayashi i Ueshima 2000; Machida et al. 2002; Tomita et al. 2002), vertebrate mitochondrial genu rearanżacje mogą być również wyjaśnione przez taki mechanizm (Desjardins and Morais 1990; Quinn and Wilson 1993; Kumazawa and Nishida 1995; Kumazawa et al., 1996; Mindell, Sorenson, and Dimcheff 1998; Miya and Nishida 1999; Inoue et al. 2001b), a jego wykonalność jest również wspierana przez częste polimorficzne duplikacje sekwencji mtDNA (np Stanton et al. 1994; Gach and Brown 1997; Mindell, Sorenson, and Dimcheff 1998; Miya and Nishida 1999). Inne sugerowane mechanizmy powołują się na nielegalną replikację przez tRNA i wypadkową integrację genów tRNA wokół regionu kontrolnego (Cantatore et al. 1987; Jacobs et al. 1989).,

chociaż drugi model nie jest wykluczony w tym momencie, pierwszy model jest faworyzowany jako mechanizm rearanżacji genów w mitogenomach gulpera. Zakładając, że długi fragment DNA w regionie tRNAIle–CR typowej organizacji jest duplikowany (rys. 4), kolejne delecje zbędnych genów dałyby początek uporządkowanej organizacji genów u węgorzy gulpera. Takie duplikacje tandemowe i późniejsze delecje najbardziej parsymoniczne prowadziły do obserwowanej kolejności genów i powiązanych z nimi odstępów międzygatunkowych w tych dwóch węgorzach.,

wiele delecji redundantnych genów wydawało się niekompletne w dwóch gulper eels, ze względu na kilka odcinków sekwencji niekodujących (rys. 2) występujące wokół genów biorących udział w przegrupowaniu (rys. 4). Chociaż nc1 i nc2 u E. pelecanoides i NC u S. lavenbergi składają się z powtarzających się pseudogenów odpowiadających degeneracyjnym kopiom sąsiedniego genu tRNA, CR1 i CR2 w Mitogenomie S. lavenbergi mają identyczne sekwencje ponad 800 bp, a CR1 znajduje się w domniemanej duplikowanej pozycji, podczas gdy CR2 znajduje się w pierwotnej pozycji regionu kontrolnego., Ta obserwacja w Mitogenomie S. lavenbergi wspiera koncepcję duplikacji tandemu i późniejszych zdarzeń delecji jako mających miejsce w regionie tRNAIle-CR (rys. 4).

Jeśli cztery z pięciu sąsiadujących ze sobą bloków genów były powielane razem we wspólnym przodku dwóch gatunków i jeśli późniejsza delecja genów miała miejsce przed specjacją, zakładane powielone części węgorzy gulper, począwszy od genu tRNAIle do CR typowej organizacji, rozciągały się ponad 12 kb (rys. 1)., Przed tym badaniem przypuszczalne zduplikowane regiony kiedykolwiek znanych przegrupowań kręgowców miały co najwyżej 4 kb. Co więcej, wszystkie znane tandemowo powtarzające się sekwencje kodowania były ograniczone do regionów sąsiadujących z regionami CR, IQM lub WANCY, prawdopodobnie odzwierciedlając sporadyczne nieprecyzyjne zakończenie replikacji poza ich pochodzeniem. Zduplikowany region w mitogenomie węgorza gulpera był znacznie większy niż w przypadku kiedykolwiek znanych rearanżacji kręgowców i obejmował prawie cały mitogenom (fig. 1).

dziękujemy kapitanom, oficerom, załodze, naukowcom i studentom na pokładzie podczas rejsu KT97-10<– –> z R/V tansei Maru i KH00-1 rejsu R / V Hakuho Maru za ich pomoc w zbieranie próbek. Badanie to nie byłoby możliwe bez hojnego darowizny materiału tkankowego S. lavenbergi, za co serdecznie dziękujemy E. O. Wileyowi. Dziękujemy również dwóm anonimowym recenzentom za cenne komentarze na temat rękopisu. Podziękowania należą się również Y., Fukuyo, K. Furuya, K. Nanba oraz absolwentom Laboratorium Oceanografii rybackiej na Uniwersytecie Tokijskim za hojne pozwolenie na korzystanie z ich obiektów eksperymentalnych oraz za Marshall Editions Ltd.; Andromeda Oxford Sp. Z O. O.; oraz Tokai University Press o pozwolenie na wykorzystanie ilustracji i fotografii. K. Pearson przedstawił istotne informacje na temat tożsamości okazu „S. lavenbergi”. Badanie to było częściowo wspierane przez granty z Ministerstwa Edukacji, Nauki i Kultury Japonii (No., 09740644, 10460081, 10660189, 11640705, 11691177, 12460083, i 12NP0201) oraz programu” badania dla przyszłości ” nr JSPS-RFTF 97L00901 od japońskiego Towarzystwa Promocji Nauki. K. T. był wspierany przez Research Foundation z Touwa Shokuhin Shinkoukai i Eel Research Foundation z Nobori-kai.

Literatura cytowana