granice w mikrobiologii

wprowadzenie

Bacillus thuringiensis i 7 innych gatunków zarodników tworzących bakterie Gram-dodatnie, w tym B. cereus, B. cytotoxicus, B. anthracis, B. pseudomycoides, B. weihenstephanensis, B. toyonensis I B. mycoidesare, są wykrywane głównie w glebie. Ponieważ bakterie te są bardzo podobne pod względem genotypu i fenotypu, bakterie są klasyfikowane jako grupa B. cereus w taksonomii (Park et al., 2007). B., cereus I B. thuringiensis są wysoce wykrywalne w żywności, ponieważ są obserwowane w surowcach z gleby rolniczej podczas uprawy i dystrybucji. Ponadto te dwie bakterie zwykle nie są dyskryminowane w diagnostyce klinicznej. B. cereus jest drugą grupą priorytetową ryzyka chorób przenoszonych przez żywność w świeżych produktach rolnych, a jej zanieczyszczenie jest jednym z głównych problemów w warzywach (Felício et al., 2015). W szczególności B., thuringiensis był stosowany jako pestycyd w uprawie niektórych roślin i jest dobrze znany jako insektycydy mikrobiologiczne, które były stosowane w celu zmniejszenia ilości pestycydów chemicznych (Azmi et al., 2015).

B. thuringiensis produkuje białka owadobójcze, które są głównym rodzajem krystalicznych (Cry) białek (Kutasi et al., 2016). I odwrotnie, aktywnie rosnące komórki wegetatywne, które nie produkują kryształów, prowadzą do nietoksycznych efektów. Δ-endotoksyny zawierają głównie cytolityczne (Cyt) i Cry (Elleuch et al., 2015; Rao i in., 2015)., Jednak Cyt i Cry posiadają różne homologie sekwencji, mimo że składają się z podobnych sposobów działania w kierunku lizy komórkowej, które prowadzą do trwałego uszkodzenia midguta owada (Adang et al., 2014).

zmienność strukturalna czterech δ-endotoksyn (Cry1, Cry2, Cry3 i Cyt2Ah) została zaobserwowana w krystalografii rentgenowskiej (Dehury et al., 2013). Geny te są identyfikowane w transgenicznej bawełnie i innych warzywach, które są znacznie skuteczne w zwalczaniu szkodników., Projektowanie biomarkera dla tłumaczonego produktu różni się w zależności od różnych kategorii białka cry; stąd wykrywanie będzie złożone. Sekwencje genów 16S rRNA oparte na podstawnikach uniwersalnych wykazały duże podobieństwo (>99%) między B. cereus I B. thuringiensis (Böhm et al., 2015), których nie można zaklasyfikować za pomocą testów genetycznych i fenotypowych (Peng et al., 2015). Ponadto od 2000 roku toczy się dyskusja na temat tego, czy cała grupa B. cereus powinna być traktowana jako złożony gatunek różnorodnych bakterii (Helgason et al.,, 2000; Bartoszewicz i Marjańska, 2017). Istnieją również sugestie, że filogeneza tych bakterii lepiej pasuje do ich właściwości ekologicznych (psychrotolerancja, zjadliwość) niż do przynależności taksonomicznej (Drewnowska i Świecicka, 2013; Bartoszewicz i Marjańska, 2017). Aby rozwiązać ten problem, skierowaliśmy XRE do wykrycia B. thuringiensis, który kontroluje główny rodzaj produkcji białek krystalicznych.

te dwie bakterie są bardzo podobne w wynikach biochemicznych (Böhm et al., 2015), oraz właściwości genetyczne (Osman et al., 2015). Cho i in., (2015) poinformował również, że właściwości genetyczne i fenotypowe między tymi bakteriami są ledwo odróżnialne. Ponadto Pfrunder et al. stwierdzono, że gatunki z grupy B. cereus nie mogą być wiarygodnie zidentyfikowane za pomocą klasycznego biotypowania (Pfrunder et al., 2016). Na ich podstawie eksperymenty biochemiczne mogą nie wystarczyć do różnicowania. Zamiast tego obecność owadobójczego białka krystalicznego została użyta jako wyróżniona cecha odróżniająca te bakterie (Ekino et al., 2014; Wei et al., 2018).,

niektóre z czynników różnicujących te dwie bakterie są oparte na ich chorobotwórczości w próbkach. B. cereus powoduje zaburzenia żołądkowo-jelitowe, podczas gdy B. thuringiensis był również zaangażowany w epidemie biegunki. Jak donoszono, cechą wyróżniającą B. thuringiensis jest obecność owadobójczych białek krystalicznych (δ-endotoksyna) kodowanych przez geny cry (Osman et al., 2015; Albright et al., 2016). Od metody identyfikacji wykorzystującej biomarker do różnicowania B., Grupa cereus jest złożona i czasochłonna, bardzo wydajny biomarker jest pilnie potrzebny, aby zastąpić poprzednie, które dawały niższą wydajność, a czasami nawet wykazały fałszywe wyniki. Na podstawie dwóch specyficznych genów, regulatora transkrypcyjnego i genów białka krystalicznego dla B. thuringiensis (Porcar and Juárez-Pérez, 2003; Han et al., 2006), obecne badanie zostało przeprowadzone w celu sprawdzenia i porównania skuteczności zaprojektowanego biomarkera (XRE) do skuteczności istniejącego markera białka krystalicznego (cry2) w identyfikacji szczepów B. thuringiensis z grupy B. cereus (BCG) i nie-B., szczepy grupy cereus (non-B) w żywności. Cry2 jest najczęstszym białkiem krystalicznym obecnym w B. thuringiensis (Liang et al., 2011; Palma i in., 2014).

materiały i metody

przygotowanie kultur bakterii

wszystkie 120 szczepów, w tym 111 szczepów Bcg i 9 szczepów non-B, uzyskano ze zbiorów bakterii w Stanach Zjednoczonych i Korei Południowej (tabela uzupełniająca 1). Wśród zbiorów B. thuringiensis ATCC 10792 (Typ szczep) został wykorzystany do optymalizacji warunków eksperymentalnych konwencjonalnego PCR i PCR w czasie rzeczywistym., Wszystkie szczepy rozmrażano w temperaturze pokojowej (25°C) i smugowano na agarze odżywczym (Difco, MI, Stany Zjednoczone). Po wyhodowaniu przez 24 godziny w temperaturze 35°C w inkubatorze pobrano czystą kolonię i zaszczepiono w tryptycznym bulionie sojowym (Difco, MI, Stany Zjednoczone), a następnie wykorzystano posiewy nocne do kolejnych eksperymentów.

konstrukcja podkładu i Izolacja DNA

odpowiednie podkłady kierujące XRE do różnicowania B., thuringiensis (Tabela 1) zostały zaprojektowane zgodnie z następującą sekwencją w Bacillus thuringiensis ATCC 10792 (Gen – 3664610-3665047) przy użyciu oprogramowania Primer Express® (Wersja 3.0.1) z Applied Biosystems z siedzibą w CA w Stanach Zjednoczonych i zsyntetyzowane przez Bioneer Corporation z Daejeon w Korei. Wydajność zaprojektowanego XRE porównano z cry2 (Ben-Dov et al., 1997). Po 24-godzinnym wzbogacaniu w TSB poddano ekstrakcji genomowego DNA z użyciem odczynnika PrepMan® Ultra Sample Preparation (Applied Biosystems, CA, Stany Zjednoczone) podwielokrotność 1 mL bakterii., Stężenia DNA zostały zmierzone za pomocą fluorescencji Biospektrometru Eppendorf® (Eppendorf, Hamburg, Niemcy) i skorygowane do 10 ng/µL. Próbki DNA przed użyciem przechowywano w temperaturze -20°C.

konwencjonalny test PCR i PCR w czasie rzeczywistym

konwencjonalny test PCR został przygotowany za pomocą termicznego roweru C1000 TouchTM firmy Bio-Rad z siedzibą w Hemel Hempstead w Wielkiej Brytanii., W probówce reakcyjnej dla PCR zastosowano Accu-Power ® Pyro Hot Start TAQ PCR Pre-Mix firmy Bioneer Corporation z siedzibą w Daejeon w Korei i o objętości 20 µL, w tym 1 µL każdego podkładu (10 pmoL/µL) i 2 µL DNA. Warunki amplifikacji konwencjonalnego PCR dla regulatora transkrypcyjnego (XRE) to: wstępna denaturacja w 95°C przez 5 min, następnie 35 cykli denaturacji w 95°C przez 30 s, wyżarzanie w 49°C przez 30 s i wydłużenie w 72°C przez 30 s, a końcowe wydłużenie w 72°C przez 5 min., Warunki amplifikacji dla białka krystalicznego (Cry 2) to: wstępna denaturacja w 95°C przez 5 min, następnie 35 cykli denaturacji w 95°C przez 30 s, wyżarzanie w 55°C przez 30 s i wydłużenie w 72°C przez 1 min, a końcowe wydłużenie w 72°C przez 5 min. Po amplifikacji DNA, 1,5% (W/V) roztwór żelu agarozowego zawierający roztwór kwasu nukleinowego RedsafeTM 20 000 × (Intron Biotechnology, Inc .) został przygotowany i elektroforeza żelowa została wykonana przy użyciu Sub-komórki modelu 192 z Bio-Rad z siedzibą w Hemel Hempstead, Wielka Brytania., Opaski zostały wizualizowane za pomocą systemu Imager Smart View Pro UVCI-1100 firmy Major Science zlokalizowanej w Kalifornii w Stanach Zjednoczonych. Dokładność (AC) została użyta do oceny metody PCR z wykorzystaniem primerów XRE i cry2 w wykrywaniu B. thuringiensis z Bcg i non-B. negative agreement (na) oznacza taki sam negatywny wynik dla non-B. thuringiensis z wykorzystaniem PCR z XRE i cry2. Pozytywna zgoda (PA) oznacza taki sam pozytywny wynik dla B. thuringiensis przy użyciu PCR z XRE i cry2. Dokładność (AC) jest mierzona za pomocą następującego równania, AC = ×100% (Ma et al., 2014).,

eksperymenty PCR w czasie rzeczywistym zostały przeprowadzone przez system StepOneTM real-time PCR z Applied Biosystems zlokalizowanego w CA, Stany Zjednoczone. Objętość reakcji 20 µL składająca się z 10 µL mieszanki topliwej DoctorTM High Resolution Melting (HRM) Master Mix, 2 µL DNA, 0,5 µL podkładu F/R (10 pmoL/µL) (Tabela 2). Warunki amplifikacji qPCR to: początkowa denaturacja w temperaturze 95°C przez 10 min i 40 cykli w temperaturze 95°C przez 15 s i 60°C przez 1 min. Następnie, w kolejnej analizie krzywej topnienia, temperaturę ustawiono na wzrost z 60 do 95°C przy 0,3°C / cykl, aby sprawdzić specyficzność podkładu.,

ocena testu PCR w czasie rzeczywistym

skuteczność XRE i cry2 oceniono przy użyciu 50 szczepów B. thuringiensis, podczas gdy wyłączność badano przy użyciu 70 bakterii niebędących przedmiotem zwalczania, w tym 58 B. cereus (Bc), 3 BCG i 9 non-B (Chelliah et al., 2017). Standardowa krzywa została wykonana przy użyciu 10-krotnego rozcieńczenia DNA ekstrahowanego z B. thuringiensis ATCC 10792., Stężenia DNA skorygowano od 10 ng / µL do 100 fg / µL, co odpowiada 2,6 × 106 do 2,6 × 10 CFU, a amplifikacje przeprowadzono za pomocą PCR w czasie rzeczywistym z triplikatami. Do kontroli ujemnych użyto wody destylowanej. Wyniki ujemne lub krzywe amplifikacji nie były brane pod uwagę, gdy wartości progowe cyklu (Ct) były większe niż 40.

wykrywanie B. thuringiensis w próbkach z kolcami

sałata (Lactucasativa), Kimbab i szpinak (Spinaciaoleracea) zostały zakupione na lokalnym rynku w Chuncheon w Korei., Próbki przebadano na obecność bakterii docelowych zgodnie z normą ISO 7932 (2004). W sterylnym worku stomachera z Nasco Whirl-Pak zlokalizowanym w WI w Stanach Zjednoczonych przygotowano podróbkę po 50 g każdego rodzaju pokarmu. Przez Noc Kultury B. thuringiensis rozcieńczono w 0,5% wodzie peptonowej i wykorzystano do przygotowania sztucznie zanieczyszczonych próbek o poziomach zaszczepienia od 103 do 105 CFU/g (Chon et al., 2012; Kim i in., 2013). Podwielokrotność 1 mL zawiesiny próbek żywności została przeniesiona do nowej sterylizowanej probówki i wykorzystana do ekstrakcji DNA.,

wyniki i dyskusja

wykrycie B. thuringiensis za pomocą genu cry2

dla 120 szczepów uzyskano produkty amplifikacji o wartości około 700 bp przy użyciu primerów Cry2 (Tabela 1). Jak pokazano w tabeli 2 i na rysunku 1, podczas stosowania PCR ukierunkowanych na cry2, wzmocniono 6 szczepów B. cereus i 36 szczepów B. thuringiensis (72%). Żadna inna grupa B. cereus ani grupa B nie została wzmocniona. To wykazało dokładność 82% cry2 do wykrywania grup B. cereus. Dla 120 badanych szczepów 100 szczepów dało NAs lub PAs, co wskazuje na ogólną dokładność procentową 83.,3% (Tabela Uzupełniająca 1). Podczas gdy Riojas et al. (2015) zgłosił multipleks PCR genu nie-rybosomalnej syntazy peptydowej (NRPS) i cry1 w celu identyfikacji B. cereus I B. thuringiensis o swoistości 24,5% w B. cereus i 15% W B. thuringiensis.

stwierdzono, że szczep B. thuringiensis może syntetyzować jedno lub więcej białek krystalicznych, ponieważ znaleziono jeden lub więcej genów toksyny krystalicznej dla B. thuringiensis. Głównym powodem różnorodności genów toksyny jest transfer plazmidów w B. thuringiensis (Adang et al., 2014). Jest to częsty proces transferu plazmidu przez koniugację lub mobilizację (Makart et al., 2017)., Ponadto wymiana genów cry generuje B. cereus z nowym wiązaniem cry, które prowadzi do podobieństwa B. cereus I B. thuringiensis (Fiuza, 2015). Ponadto, z innym źródłem izolacji, geny cry wykazały różnicę w różnorodności i dystrybucji. Na przykład w każdym środowisku można znaleźć nowy gen płaczu, który wykazuje inną aktywność owadobójczą.

wykrywanie B. thuringiensis za pomocą genu XRE

potencjalne sekwencje kodujące (CDS) przewidywano jako regulatory transkrypcji., CDS zawiera motyw Helix-turn-helix (HTH) w regulatorach transkrypcyjnych z rodziny XRE i rodziny MerR, wcześniej odpowiadające sekwencje genu XRE w pBMB28 B. thuringiensis YBT-020 i pCT281 B. thuringiensis (GenBank: CP001910). CDS50, który jest związany z regulatorem transkrypcyjnym typu HTH, SinR, był identyczny z odpowiadającym mu elementem pG9842 B. cereus G9842 (GenBank: CP001187). Białka HTH, wraz z czynnikami sigma, uczestniczą w szerokim zakresie szlaków sygnałowych, na przykład jako repsory, które hamują sporulację (Murawska et al.,, 2014), tworzenie biofilmu (Colledge et al., 2011), oraz wydzielanie proteazy (Pflughoeft et al., 2011). Oprócz Cry1Ab21 i δ-endotoksyny zakodowanej w toksynowym plazmidzie pIS56-63, które są odpowiedzialne za koniugację i sporulację (Martínez-Núñez et al., 2010; Deng et al., 2014) oprócz 53 różnych zakodowanych białek domniemanych.

wyniki PCR z XRE wykazały, że żaden z 58 B. cereus lub non-b nie dawał amplifikacji (Tabela 2 i rysunek 1). W sumie z 50 szczepów B. thuringiensis 47 wykazało pozytywne wyniki (94%). Wynik ten wykazał dokładność 97.,3% XRE do wykrywania B. thuringiensis wśród badanych grup B. cereus. Dla 120 badanych szczepów 117 szczepów podawało NAs lub PAs, co wskazuje ogólny procent dokładności wynoszący 97,5% (dodatkowa Tabela 1).

Standard Curve and Amplification Efficiency

badanie PCR w czasie rzeczywistym przeprowadzono przy użyciu ekstraktów DNA z czystych kultur szczepu B. thuringiensis typu ATCC 10792 ukierunkowanych na gen XRE. Opracowany test PCR w czasie rzeczywistym był skuteczny w wykrywaniu stężeń od 2,6 × 10 do 2,6 × 106 CFU/reakcji, które obejmowały 6 rzędów wielkości., Równanie liczby kopii log w stosunku do wartości Ct dla B. thuringiensis wynosiło y = -3,853 x+21,244 przy r-kwadratowej wartości 0,993, co wskazuje na dużą liniowość (Rysunek 2).