Integral membrane Proteins

Integral membrane proteins (IMPs) działają jako bramy do komórek. Wszystkie komórki i organelle są zamknięte w nieprzepuszczalnej dwuwarstwowej warstwie lipidowej, a chochliki, które badamy, są osadzone w tych błonach. Są to drogi wejścia i wyjścia dla wielu jonów, składników odżywczych, produktów odpadowych, hormonów, leków i dużych cząsteczek, takich jak białka i DNA. Są one również odpowiedzialne za znaczną część komunikacji między komórkami a ich środowiskiem., Komórki mogą tworzyć ogromną różnorodność tych białek, około 30% genów w ludzkim kodzie genomu dla białek błonowych, a jednak wiemy stosunkowo niewiele o tych cząsteczkach.

białka błonowe są niestety notorycznie trudne do obsługi i badania, ponieważ są przeznaczone do siedzenia w środowisku hydrofobowym dwuwarstwy lipidowej. Wydają się być niestabilne, gdy są wydobywane z ich rodzimego środowiska i musimy dodać detergenty, aby pokryć powierzchnię hydrofobową., W celu zrozumienia i kontrolowania funkcji tych białek niezbędne jest posiadanie informacji o ich trójwymiarowej strukturze, która jest zwykle uzyskiwana przez krystalografię rentgenowską. Jednak trudności z obsługą tych białek sprawiły, że trudno było rozwiązać struktury, a do tej pory znanych jest mniej niż 300 struktur białek błonowych, mniej niż 0,5% wszystkich znanych struktur. Dla wyższych eukariotów historia jest jeszcze bardziej surowa, z rozwiązanymi tylko 20 strukturami ludzkich chochlików i mniej niż 50 chochlików ssaków., Białka błonowe są więc jednym z najważniejszych obszarów badań biologii strukturalnej. W SGC stosujemy obecnie nasze najnowocześniejsze metody o wysokiej przepustowości, aby przezwyciężyć wąskie gardła w badaniach nad białkami błonowymi, dzięki czemu możemy niezawodnie dostarczać czyste próbki białek błonowych i struktury tych fascynujących i kluczowych medycznie cząsteczek.

znaczenie medyczne

znaczenie medyczne tej ogromnej rodziny białek nie może być przeceniane., Mutacje w białkach błonowych biorą udział w wielu typowych chorobach, w tym w chorobach serca, gdzie często dochodzi do nieprawidłowego funkcjonowania kanałów jonowych. Leki ukierunkowane na kanały wapniowe mogą kontrolować problemy, takie jak wysokie ciśnienie krwi i dławica piersiowa. Białka błonowe biorą udział w nowotworach, gdzie błędy w szlakach sygnałowych mogą prowadzić do podziału komórek poza kontrolą. Często specyficzne białka błonowe są nadprodukowane w komórkach nowotworowych i dlatego są celami terapii farmakologicznej. Choroby mózgu, takie jak migrena, depresja i Alzheimer są związane z problemami z transporterami i kanałami., Mukowiscydoza jest spowodowana mutacjami w genie Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), który koduje kanał jonów chlorkowych.

ponieważ wiele białek błonowych siedzi na powierzchni komórek, są one łatwo dostępne dla leków drobnocząsteczkowych krążących we krwi. Nic więc dziwnego, że ponad 50% leków małocząsteczkowych wiąże się z białkami błonowymi. Receptory i kanały sprzężone z białkiem G są szczególnie ważne pod tym względem, ale transportery ABC i nośniki rozpuszczone są również celami terapii lekowej., Nasze zrozumienie wielu innych chorób i nasza zdolność do leczenia tych chorób znacznie skorzysta z bardziej strukturalnych i funkcjonalnych informacji na temat białek zaangażowanych. Mamy nadzieję, że poprzez rozwiązywanie struktur tych białek, zrozumienie podstawowych biochemii i interakcji z substratami i inhibitorami, możemy zapewnić bardziej skuteczne leczenie wielu chorób.

SGC i integralne białka błonowe

SGC ma duże doświadczenie w rozwiązywaniu struktur rozpuszczalnych białek ludzkich przy użyciu wysoce wydajnych, wysokoprzepustowych systemów., W ciągu ostatnich dwóch lat zaadaptowaliśmy te metody do rozwiązywania struktur ludzkich białek błonowych. Przebadaliśmy 186 ludzkich białek błonowych z różnych rodzin, wybierając szereg konstrukcji dla każdego białka, identyfikując odpowiednie detergenty do oczyszczania, a następnie skalując purificaiton i krystalizując te białka. Skrystalizowaliśmy 3 białka błonowe i rozwiązaliśmy naszą pierwszą strukturę, proces, który trwał mniej niż dwa lata od pierwszego klonu do struktury.,

rozwiązaliśmy pierwszą strukturę ludzkiego transportera ABC, klasy białek, które biorą udział w transporcie małych cząsteczek, wielolekooporności i chorobach takich jak mukowiscydoza i cukrzyca. Naszym pierwszym udanym celem jest ludzki mitochondrialny transporter ABC, ABCB10, który jest osadzony w wewnętrznej błonie mitochondriów. ABCB10 ulega nadmiernej ekspresji podczas różnicowania erytroidalnego, procesu, w którym powstają krwinki czerwone. jest nadekspresowany w szpiku kostnym, sercu i wątrobie., Obecnie istnieją dowody, że gdy ekspresja ABCB10 jest zmniejszona w komórkach, są one bardziej podatne na stres oksydacyjny i że ABCB10 może być zaangażowany w ochronę serca podczas zawału serca.

technologie do badania IMPs

opracowujemy metody generyczne, które umożliwiają wysokowydajne wyznaczanie struktur ludzkich białek błonowych. Wybraliśmy system ekspresji komórek bakulowirusa/owadów, który zapewnia skład lipidów zbliżony do składu komórek ludzkich i jest sprawdzoną platformą o wysokiej przepustowości., Dla każdego białka docelowego generujemy szereg konstruktów o różnej długości i różnych znacznikach powinowactwa, w tym gen o Pełnej długości i serię cięć w celu usunięcia potencjalnie nieuporządkowanych regionów. Ekran ekspresji o wysokiej przepustowości służy do identyfikacji białek, które mogą być używane do oczyszczania miligramowych ilości IMPS do krystalizacji. Każde białko jest początkowo oczyszczane w detergencie dodecylo maltozydu (DDM), a następnie przesiewane pod kątem stabilności w szeregu różnych detergentów w celu określenia optymalnych warunków stabilności i krystalizacji.,

opracowaliśmy metody wysokowydajnej krystalizacji nanodropów i manipulacji kruchymi Kryształami białek błonowych. Opracowaliśmy wydajne systemy przesiewania kryształów białka membranowego pod kątem jakości dyfrakcji jako metodę optymalizacji warunków krystalizacji. Zoptymalizowaliśmy również nasze gromadzenie i analizę danych dyfrakcyjnych przy użyciu intensywnych linii synchrotronowych wiązek mikrofokusa, dostępnych w takich zasobach, jak Diamond Light Source Ltd, w Oxfordshire., Tam, gdzie to możliwe, krystalizacja odbywa się za pomocą powiązanych ligandów i inhibitorów, aby uchwycić pojedynczą natywną konformację i zapewnić kluczowy wgląd w funkcjonowanie i projektowanie leku. Planujemy również wygenerować fragmenty przeciwciał przeciwko naszym oczyszczonym białkom do wykorzystania jako odczynniki powinowactwa i pomoce do krystalizacji.