potencjalne działanie antyproteolityczne L-leucyny: obserwacje badań in vitro i In vivo

zanik mięśni szkieletowych jest uważany za ważny problem zdrowia publicznego ze względu na jego pierwotne (zmiany metaboliczne) i wtórne konsekwencje (utrata siły, zmniejszona Autonomia). Jak wiadomo, proces atrofii staje się widoczny, gdy degradacja białek mięśni szkieletowych wzrasta ponad syntezę białek w dłuższym okresie czasu., W tym kontekście suplementacja leucyny wydaje się obiecującą terapią przeciw atrofii, działającą albo poprzez hamowanie proteolizy mięśni szkieletowych i/lub zwiększenie syntezy białek, efekt, który może być zarówno zależny od dawki, jak i zależny od stanu zaniku mięśni szkieletowych. W niniejszym przeglądzie omówione zostaną efekty suplementacji leucyny w regulacji proteolizy mięśni szkieletowych zarówno w badaniach in vitro, jak i In vivo.,

Przeciwatroficzne efekty suplementacji leucyny

oszczędne efekty białkowe suplementacji leucyny są znane od początkowych badań Buse& Reid (1975) ., Ze względu na swoje właściwości izolowanego działania, leucyna jest w rzeczywistości uważana nie tylko za białko AA stanowiące białko, ale także za podmiot fizjofarmakologiczny, którego podawanie jest w stanie promować ważne działania antykataboliczne, takie jak osłabienie katabolizmu mięśni szkieletowych podczas odchudzania, ułatwienie procesu gojenia i poprawę obrotu białkami mięśni szkieletowych u osób starszych .,

ogólnie rzecz biorąc, suplementacja leucyny konsekwentnie wykazuje zmniejszenie proteolizy mięśni szkieletowych po podaniu dożylnym, inkubacji z całym mięśniem, inkubacji z komórkami mięśni szkieletowych i podczas karmienia doustnego . Należy zauważyć, że wielkość hamowania różni się w zależności od gatunku, stanu patologicznego, a zwłaszcza od modelu atrofii., Co ważne, w hodowlach komórek mięśni szkieletowych występuje również antyproteolityczne działanie suplementacji leucyny, ale w tym układzie efekt zależny od dawki leucyny wydaje się być przesunięty do niskiego zakresu stężeń w porównaniu do inkubacji całego mięśnia .

w badaniach przewlekłych skuteczność suplementacji leucyny nie jest tak dobrze wykazana jak w badaniach ostrych, ale na tym poziomie suplementacja leucyny wykazuje również istotne działanie antyproteolityczne. W rzeczywistości, ostatnie badania przeprowadzone przez Combaret et al. (2005) wykazał, że doustna przewlekła suplementacja leucyny (~0.,7 g/kg mc. / dobę przez okres 10 dni) wykazywały długotrwałe działanie hamujące proteolizę mięśni szkieletowych o około ~30%, przywracając wadliwe poposiłkowe hamowanie proteolizy zależnej od proteasomu. Potwierdza również dowody zmniejszonej proteolizy indukowanej suplementacją leucyny, badanie przeprowadzone przez Ventrucci et al. (2004) wykazał, że u szczurów wywołanych kacheksją nowotworową spożycie diety wzbogaconej leucyną (3%) w okresie 20 dni zmniejszyło degradację białka w mięśniach gastrocnemius o około 11%, zwiększając zawartość ciężkiego łańcucha miozyny o około 47%., Ostatnio, z tym samym projektem badania, Eley et al. (2007) wykazano, że spożycie 1 g/kg BCAA/dzień przez 12-15 dni hamuje utratę masy ciała o około 33% i zmniejsza degradację białka o około 62% w mięśniach soleus. Jednak przeciwnie, Sadiq et al. (2008) wykazał, że u cieląt 5-dniowy wlew dożylny EAA (renderujący poziomy plazmatyczne leucyny ~0,24 mM) pod deficytami energii i białek poprawił bilans azotowy, ale proteoliza mięśni szkieletowych nie została osłabiona., Ogólnie rzecz biorąc, przewlekłe badania wykazały suplementację leucyny jako ważną strategię przeciw atrofii, ale brak standaryzacji związanej z dawką suplementacji leucyny (spożywaną i wchłanianą) osłabia główne wnioski związane z wielkością efektu. Tabela 1 podsumowuje ważne badania związane z wpływem leucyny na proteolizę mięśni szkieletowych zarówno u ludzi, jak i zwierząt.,

ostra suplementacja leucyny: zależność między dawką a efektem

aby uzyskać skuteczność suplementacji AA, konieczne jest zrozumieć jego właściwości dawka-efekt., W tym względzie Grupa Michaela Renniego dokonała ważnych odkryć związanych z istnieniem krzywoliniowej zależności dawka-odpowiedź między pozakomórkowym EAA (szczególnie leucyną wśród nich) a syntezą białek mięśni szkieletowych człowieka . Koncepcja jest taka, że w normalnych warunkach pojedynczy posiłek wydaje się promować maksymalny wpływ na syntezę białek. Stwierdzenie to opiera się na badaniach przeprowadzonych zarówno na dorosłych szczurach, jak i na dorosłych ludziach, wykazujących, że stężenie leucyny w osoczu w stanie PA wynosi około 0.,1 mM, a w stanie PP zwiększa się o około 80% lub więcej, co daje średnie wartości 0,2 mM. wartość ta wydaje się być zdolna do promowania maksymalnego wzrostu syntezy białek i nasycenia układu .

gdy problemem jest zahamowanie degradacji białek, znacznie mniej wiadomo o tej właściwości efektu dawki, nawet w badaniach na zwierzętach. Wyniki przedstawione w literaturze wykazują różnice w zależności od badanych mięśni szkieletowych, izotopu wykorzystywanego do pomiaru metabolizmu białek i badanego układu (badania in vitro vs in vivo)., Jednak głębsza analiza tych badań, zwłaszcza badań in vitro (gdzie możliwe jest jednoczesne wykrywanie syntezy białek i metabolizmu degradacji białek), ujawnia nowe wyniki pomimo różnic metodologicznych. Tak więc, ponowna interpretacja tych badań jest uzasadniona, aby wygenerować nową koncepcję dotyczącą zależności dawka-efekt leucyny.,

w hodowlach komórek mięśni szkieletowych brak aminokwasów (zwłaszcza leucyny) wydaje się kontrolować degradację białek głównie poprzez aktywację proteolizy zależnej od lizosomów dodatkowo, podczas całych inkubacji mięśni, suplementacja leucyny prowadzi do zmniejszenia aktywności proteolitycznej zależnej od ATP-ubikwityny . Jednak nadal nie ma aktualnej mechanistycznej informacji o tym, jak sygnał odżywczy indukowany przez AA jest wyczuwany przez komórkę mięśniową (tj. wewnątrzkomórkowo lub zewnątrzkomórkowo). Kilka badań Mortimore i współpracowników i Pösö et al., (1982) , wykazał, że w wątrobie dodatkowe stężenie komórkowe AA dyktuje w sposób zależny od dawki, hamowanie proteolizy wewnątrz komórek wątroby, a wśród AA leucyna była najsilniejszym inhibitorem.

w przypadku mięśni szkieletowych wewnątrzkomórkowe stężenie AA nie jest dostępne w większości badań., Jednak na podstawie dodatkowych stężeń komórkowych AA (poziomów plazmatycznych i/lub poziomów dodatkowych komórek) można założyć, że stężenie leucyny obecne w celu kontrolowania syntezy białek jest również dostępne w celu kontrolowania degradacji białek, niezależnie od procesu mechanizmu. W oparciu o to założenie poniżej podsumowano wyniki kilku badań. Sugerują one, że dawka leucyny zdolna do wywołania maksymalnego wpływu na degradację białek może być wyższa niż dawka zdolna do wywołania maksymalnego wpływu na syntezę białek w warunkach ujemnego bilansu białek., Wydaje się jednak, że to zależne od dawki działanie nie występuje w hodowlach komórek mięśni szkieletowych .

badania na zwierzętach

we wcześniejszym badaniu z 1977 r., Buse& Weigand wykazał, że mięśnie przeponowe szczurów inkubowane ze stężeniem leucyny 0,5 mM (dwa razy większym niż stężenie leucyny stwierdzone w stanie PP) były w stanie zwiększyć syntezę białek mięśni szkieletowych w 36-38%. Jednak degradacja białka została zahamowana w 4.,7%, co wskazuje, że wysokie fizjologiczne stężenie leucyny jest w stanie zarówno silnie stymulować syntezę białek, jak i w mniejszym stopniu hamować degradację białek, nawet przy braku podaży hormonalnej. W porozumieniu z tym, Tischler et al. (1982) , inkubowane mięśnie przeponowe szczura o szerokim stężeniu leucyny (od stanu PA do PP). Zaobserwowano, że stężenie leucyny wynoszące 0,1 mM znacznie zwiększyło syntezę białek mięśni szkieletowych. Jednak to samo stężenie leucyny (0.,1 mM) nie wpłynęło na tempo degradacji białek, które uległo zmianie dopiero po zwiększeniu stężenia leucyny do zakresu od 0,2 do 0,5 mM. w tym zakresie stężenia degradacja białek stopniowo zmniejszała się o większą wartość bezwzględną niż ta, która stymulowała syntezę białek (Tabela 1).

w celu sprawdzenia, czy wyniki te były obserwowane tylko podczas podawania AA in vitro, Kee i wsp., (2003) dokonał badania z wykorzystaniem mięśni prostowników digitorum longus, z podażą odżywczą zapewnianą w warunkach in vivo (infused), w obecności endogennych czynników hormonalnych. Wyniki wykazały, że u 48-godzinnych głodujących szczurów, 4-godzinny wlew AA zwiększył stężenie leucyny w osoczu do wartości około 0,57 mM. to zwiększenie stężenia leucyny w osoczu było w stanie przywrócić stężenie insuliny i kortykosteronu do wartości obserwowanych u kontrolowanych szczurów, jednocześnie zwiększając syntezę białek mięśni szkieletowych u 55,6%., Jednak przy tym samym stężeniu leucyny, proteoliza mięśni szkieletowych została zmniejszona do zaledwie 17,9% (wartość niestatystycznie różna od grupy głodującej), co sugeruje, że nawet w obecności czynników hormonalnych stężenie leucyny zdolne do stymulowania syntezy białek jest atenuowane w porównaniu z degradacją białek.

w innym badaniu Hong& Layman (1984) analizował mięśnie soleus głodujących szczurów (24 h i 72 h postu) inkubowanych z leucyną (0,5 mM)., Zaobserwowano, że u 24-godzinnych i 72-godzinnych szczurów na czczo, synteza białek wzrosła odpowiednio o 59% i 24%, ale degradacja białek nie uległa zmianie, wykorzystując to stężenie leucyny w mięśniach soleus. Wręcz przeciwnie, Busquets et al. (2000) , inkubowane mięśnie szczura soleus o wyższym stężeniu leucyny 5 mm i 10 mM. zaobserwowano, że proteoliza mięśni szkieletowych była hamowana w sposób dawkowo-odpowiedziowy, tj. stężenie leucyny 5 mM powodowało zahamowanie o 5,7% w proteolizie, podczas gdy 10 mM powodowało zahamowanie o 24,5%., Badanie to ujawnia, że zwiększenie stężenia leucyny do wartości 10-20× tych, które zaobserwowano w innych badaniach, było w stanie doprowadzić do zmniejszenia proteolizy mięśni szkieletowych, wynik ten jest zgodny z innym badaniem przeprowadzonym przez Mitchell et al. (2004), który zaobserwował, że inkubacja komórek mięśni szkieletowych o stężeniu leucyny 5 mM była zdolna do hamowania proteolizy mięśni szkieletowych W 8-12%., Tak więc nie ustalono jeszcze plateau stężenia leucyny związanego z hamowaniem degradacji białek mięśni szkieletowych w warunkach in vitro, ale badania te sugerują, że stężenie leucyny 10-20× wyższe niż w stanie PP (~0,2 mM) jest nadal w stanie wywierać działanie anty proteolityczne.,

ograniczenie powyższych badań polegało na tym, że chociaż pomiary in vitro jakościowo odzwierciedlają Tempo obrotu białek, które występowały u nienaruszonego zwierzęcia przed okresem inkubacji, metabolizm białek mierzony w całym mięśniu w warunkach in vitro zawsze był w wyraźnym stanie ujemnego bilansu białek, nawet w mięśniach kontrolnych . Jednak ta sytuacja może naśladować ten obserwowany w Warunkach atroficznych in vivo, gdzie degradacja białek mięśni szkieletowych jest zwiększona przez syntezę białek ., Tak więc, w pewnych warunkach atroficznych, możliwe jest, że ilość uzupełnionej leucyny zdolnej do maksymalnego hamowania proteolizy mięśniowej może być większa niż ilość stosowana do uzyskania maksymalnego wpływu na syntezę białek.

badania na ludziach

w chwili obecnej, dokładne metody zostały wykorzystane do pomiaru syntezy białek in vivo, ale gdy problemem jest degradacja białek, różne metody przedstawiły ważne ograniczenia, zwłaszcza gdy związane z degradacją białek w mięśniach., Na przykład wydalanie z moczem 3-metylo-histydyny (3-MH) było szeroko stosowane do oszacowania rozpadu białek mięśniowych, zarówno u zwierząt doświadczalnych, jak i ludzi . Uzasadnieniem stosowania 3-MH z moczu jako miary proteolizy mięśni szkieletowych jest to, że główna część 3-MH jest obecna w aktynie mięśni i miozynie, a co ważne, 3-MH nie jest ponownie wykorzystywany do syntezy białek, będąc wskaźnikiem degradacji białek ., Jednak swoistość wydalania 3-MH z moczem została zakwestionowana, szczególnie w warunkach in vivo, ponieważ w niektórych warunkach atroficznych, takich jak uraz chirurgiczny, zaobserwowano nieproporcjonalną nadprodukcję 3-MH ze źródeł niemusowych . Inną metodologią przyjętą in vivo do pomiaru degradacji białek jest śledzenie utraty radioaktywności z białka wcześniej oznaczonego przez podawanie znacznika radioizotopu. Gdy ta metoda jest używana, głównym problemem jest to, że radioaktywne AA pochodzące z rozpadu białek, wchodzi do puli prekursorów i jest ponownie wykorzystywane do syntezy białek., Taki recykling oznaczonych AA skutkuje pozornymi wskaźnikami rozpadu, które nie doceniają rzeczywistych wskaźników degradacji . Wreszcie, ważnym pytaniem jest udział całego ciała w stosunku do tkanki mięśni szkieletowych w szybkości degradacji białka. Aby rozwiązać to pytanie, kilka badań na ludziach wykorzystali arteriovenous net balance (NB) technika oceny szybkości syntezy białek i rozpadu białek w kończynach (które są głównie mięśni), a aminokwas fenyloalanina została wykorzystana do śledzenia białka mięśniowego, ponieważ nie jest produkowany ani metabolizowany w mięśniach., Za pomocą tej techniki rozpad białek mięśniowych można oszacować na podstawie obliczonej wartości szybkości pojawienia się fenyloalaniny do żyły, w stanie stacjonarnym w stężeniu aminokwasów we krwi. Jednak ogólny problem z wykorzystaniem zarówno przedramienia lub nogi arteriovenous NB techniki oceny metabolizmu mięśni Ostro, jest to, że podejście to ma praktyczne ograniczenia związane z czasem i krwi wymagane i, co ważniejsze, nie pozwala na ocenę krótkotrwałego wpływu na metabolizm białek mięśniowych, trudne dawki odpowiedzi badania proteolizy., W ogóle, chociaż istnieje brak wiarygodnych metod pomiaru degradacji białek in vivo w mięśniach szkieletowych, rozpad białek całego ciała można oszacować na podstawie strumienia izotopów znakowanych radioizotopami lub stabilnych izotopów w osoczu lub azotu w moczu.

kilku autorów wykazało, że leucyna, jak również suplementacja BCAA (doustnie lub we wlewie) jest zdolna do obu, zwiększając syntezę białek lub zmniejszając degradację białek u ludzi ., W większości badań na ludziach istnieje ogólna tendencja do wykazywania, że suplementacja leucyny jest zdolna do promowania efektów oszczędzających białko, głównie z powodu hamowania degradacji białek . Chociaż w kilku badaniach wydawało się, że spadek proteolizy występuje, nie ma konsensusu co do zależności dawka-odpowiedź. Na przykład, Tessari et al. (1987) podawano roztwór AA u pacjentów (stan PA) przez 180 min, osiągając poziom plazmazy leucyny 0,2 mM i nie stwierdzono wpływu na endogenną supresję proteolizy, podczas gdy Castellino et al., (1987) podawał roztwór AA (pacjenci w stanie PA), który wytworzył stężenie plazmatyczne leucyny 0,28 mM w okresie 180 minut i wykazał, że endogenny strumień leucyny (wskaźnik proteolizy) zmniejszył się o 41,8% w porównaniu do okresu podstawowego. Różnice te mogą być związane z różnymi metodologiami używanymi do analizy degradacji białek, jak zasugerował Matthews (2005) lub nawet związane z różnymi formami podawania leucyny/AA w tych badaniach, ograniczenie obserwowane również w badaniach nad syntezą białek mięśni szkieletowych.,

jak wspomniano powyżej, nie ma konsensusu co do zależności dawka-odpowiedź w badaniach na ludziach związanych z suplementacją leucyny i proteolizą mięśni szkieletowych. Jednak badanie przeprowadzone przez Sherwin (1978) wykazało, że otyli pacjenci poddani 3-dniowemu postowi wykazywali podstawowy poziom leucyny prawie dwukrotnie (0,22 mM) w porównaniu z osobami kontrolowanymi w okresie PA, stężenie leucyny normalnie zdolne do maksymalnego stymulowania syntezy białek mięśni szkieletowych w okresie PP, w normalnych warunkach., W tym badaniu infuzja leucyny zwiększyła stężenie plazmatyczne leucyny o 68% powyżej osób kontrolowanych po dwóch godzinach infuzji i o 124% powyżej osób kontrolowanych po 12 godzinach (0,81 mM), przy tej samej szybkości infuzji. Ten ostry wlew leucyny (dzień 4 na czczo) nadal był w stanie poprawić bilans azotowy, powracając do poprzedniego poziomu w dniu po wlewie. Wyniki te sugerują, że ustalony punkt metabolizmu obrotów białek związany ze stężeniem leucyny we wlewie był regulowany u tych pacjentów., W badaniu tym degradacja białek nie została zahamowana przez infuzję leucyny (mierzoną uwalnianiem 3-metylo-histydyny), ale bilans azotowy poprawił się o 23% po 12 godzinach infuzji leucyny. Ostatnie badania przeprowadzone przez Bohé et al. (2001), wskazano, że u ludzi, wlewając roztwór składający się z mieszanego AA w tempie, które wytworzyło stężenie plazmatyczne leucyny 0,4 mM, był w stanie stymulować syntezę białek tylko przez dwie godziny, powracając do Stanów podstawowych po tym okresie czasu., Możliwe jest zatem, że hamowanie degradacji mięśni szkieletowych może również przyczynić się do oszczędzania azotu podczas 12-godzinnego wlewu leucyny, przynajmniej w tkankach nie mięśniowych.

bardzo niedawno, ciekawe badanie wykonane przez Katsanos et al. (2006) porównano, u osób młodych i starszych, spożycie roztworu doustnego zawierającego EAA o stężeniu leucyny wynoszącym 26% (które zawierało podobne wartości leucyny spotykane w białku serwatkowym) w porównaniu ze spożyciem roztworu EAA wzbogaconego leucyną 41% w metabolizmie białek mięśni szkieletowych., Zaobserwowano, że u młodych osób suplementacja leucyną w małych dawkach (26%) była w stanie zwiększyć syntezę białek mięśni szkieletowych, podczas gdy u osób w podeszłym wieku nie zaobserwowano żadnego efektu (chociaż w obu grupach uzyskano podobny poziom leucyny plazmatycznej ~0,45 mM)., Jednak po uzupełnieniu mieszaniny o wysokim stężeniu leucyny (41%), u osób w podeszłym wieku zwiększono syntezę białek mięśni szkieletowych do porównywalnych wartości obserwowanych u młodych osób, przywracając wadliwą odpowiedź odżywczą obserwowaną w małej dawce uzupełnionej leucyną (chociaż ponownie w obu grupach uzyskano podobny poziom leucyny plazmatycznej ~0,65 mM). Co ważne, tylko osoby w podeszłym wieku uzupełnione 41% wzbogaconym roztworem leucyny wykazywały silną tendencję do hamowania degradacji białek., Możliwe, że u osób starszych wyższa dawka suplementacji leucyny będzie w stanie jeszcze bardziej zahamować degradację białek mięśniowych, ale hipoteza ta nie była jeszcze testowana.

Podsumowując, w badaniach na ludziach suplementacja leucyny wyraźnie indukuje hamowanie proteolizy mięśni szkieletowych i istnieją pewne rzadkie wyniki sugerujące, że stężenie leucyny zdolne do zmniejszania degradacji białek może być większe niż stężenie zdolne do maksymalnego stymulowania syntezy białek, szczególnie w Warunkach atroficznych.