przeciwciała są immunoglobulinami (IG) glikoproteinami wytwarzanymi przez komórki plazmatyczne (komórki B) w odpowiedzi na obce cząsteczki antygenowe (immunogeny). Podstawową funkcją przeciwciał jest wiązanie się specyficznie z tymi obcymi antygenami, aby je wyłączyć i / lub oznaczyć je do zniszczenia przez układ odpornościowy, chroniąc w ten sposób gospodarza przed infekcją. Istnieje kilka klas przeciwciał., Pierwsza część tego podsumowania koncentruje się na konwencjonalnych przeciwciał pełnowymiarowych, przeciwciała klasy IgG i IgM, które są silnie wykorzystywane w wielu badaniach, diagnostycznych i terapeutycznych zastosowań biomedycznych.
podstawową jednostką konwencjonalnego przeciwciała jest cztery jednostki polipeptydowe składające się z dwóch identycznych łańcuchów ciężkich i dwóch identycznych łańcuchów lekkich utrzymywanych razem przez wiązania dwusiarczkowe. Łańcuchy lekkie są krótsze, o mniejszej masie cząsteczkowej niż łańcuchy ciężkie., Ogólny kształt przeciwciało być Y, Z elastyczny zawias (interdomain) region w centrum y. elastyczność interdomain zawias region ważny dla biwalentny Wiązanie przeciwciało, pozwalać dwa wiążący kieszenie oddziaływać z antygenowymi terenami w zmienny odległościach. Każdy łańcuch polipeptydowy ma stały region, który nie różni się znacząco między przeciwciałami, i zmienny region, który jest specyficzny dla każdego konkretnego przeciwciała. Wspólna notacja dla obszaru zmiennego łańcucha lekkiego to VL, a dla obszaru stałego łańcucha lekkiego to CL (Rysunek 1)., Notacja jest podobna dla zmiennej łańcucha ciężkiego (VH) i regionów stałych (CH) z CH1, CH2 i CH3 oznaczającymi różne domeny stałego regionu łańcucha ciężkiego. Węglowodany są zwykle przyłączone do domen CH2 łańcuchów ciężkich. Region krystalizowalny fragmentu (Fc) zawiera tylko stałe regiony łańcuchów ciężkich (CH), ale Region wiązania antygenu fragmentowego (Fab) zawiera zarówno domenę stałą, jak i zmienne domeny zarówno łańcuchów ciężkich i lekkich (VH i CL). Region zmienny fragment region FV zawiera tylko dwie zmienne domeny (Rysunek 1)., Patrz przeciwciało myszy do dyskusji na temat izotypów immunoglobulin, podklas i liczby domen immunoglobulin.
każde kompletne przeciwciało ma dwie kieszenie wiążące antygen, zlokalizowane w regionach FV i może wiązać się z dwoma antygenami (Wiązanie dwuwartościowe)., Jednakże, jeżeli dwa antygeny są zbyt blisko (≤3 nm), lub zbyt daleko od siebie (≥29nm), przeciwciało może wiązać się tylko z jednym antygenem (Wiązanie monowalentne). Istnieje znacząca zmiana powinowactwa pomiędzy wiązaniami monowalentnymi i dwuwartościowymi z 1500-krotną zmianą wartości Kd .
struktura specyficznych przeciwciał jest dostępna w bazie danych strukturalnych przeciwciał (Sabdab), opierającej się na bazie publicznie dostępnych struktur przeciwciał, a także narzędzi do modelowania strukturalnego, która jest aktualizowana co tydzień z banku danych o białkach (PDB).,
konwencjonalne pełnowymiarowe przeciwciała zostały wykorzystane w badaniach do wykrywania białka poprzez Western blot analizy, immunohistochemistry i enzymatyczne immunosorbent assays (ELISA) dla dziesięcioleci. Pełnowymiarowe przeciwciała zostały również opracowane do zastosowań diagnostycznych, takich jak testy ciążowe i wykrywanie bakterii i wirusów we krwi, takich jak ELISA, która wykrywa HIV. Dodatkowo konwencjonalne pełnowymiarowe przeciwciała są powszechnie stosowane w terapii chorób., Na przykład, infliksymab jest jednym przeciwciałem z wielu dostępnych, które rozpoznają czynnik martwicy nowotworu alfa (TNFa) i jest on stosowany w leczeniu choroby Leśniowskiego-Crohna i reumatoidalnego zapalenia stawów . Trastuzumab lub Herceptin jest przeciwciałem, które wiąże się z receptorem naskórkowego czynnika wzrostu 2 i jest stosowane w leczeniu przerzutowego raka piersi . Istnieje również kilka terapii opartych na przeciwciałach, w tym Muromonab, podawany biorcom przeszczepów w celu zapobiegania odrzuceniu przeszczepu alogenicznego.,
chociaż konwencjonalne pełnowymiarowe przeciwciała mogą być stosowane zarówno w zastosowaniach terapeutycznych, istnieją zalety i wady stosowania pełnego przeciwciała. Ważną zaletą konwencjonalnych przeciwciał jest fakt, że Region Fc angażuje odpowiedź immunologiczną organizmu i może kierować związane antygeny do zniszczenia. Ten region Fc może być również wadą w niektórych zastosowaniach klinicznych, ponieważ odpowiedź immunologiczna, którą zwykle wywołuje, może być szkodliwa dla zdrowia pacjenta., Dodatkowo, pełnowymiarowe przeciwciała nie mogą przenikać do pewnych tkanek ze względu na ich stosunkowo duży rozmiar . W niektórych przypadkach, przy użyciu pełnowymiarowych przeciwciał do zastosowań diagnostycznych, domena Fc może powodować znaczące niespecyficzne Wiązanie, które może zaburzać wykrywanie zastosowań.
w wielu zastosowaniach preferowane są fragmenty przeciwciał. Fragmenty przeciwciał mogą być wytwarzane przez mechanizmy chemiczne lub genetyczne., Fragmentacja chemiczna wykorzystuje środki redukujące do zerwania wiązań dwusiarczkowych w regionie zawiasowym i trawienia przeciwciał z proteazami, w tym pepsyny, papainy i ficyny. Genetyczna Budowa fragmentów oferuje możliwość tworzenia wielu cząsteczek zawierających fragmenty, z których każda ma unikalne właściwości wiążące i funkcjonalne.
chemiczne i proteazowe trawienie pełnowymiarowych przeciwciał IgG lub IgM daje fragmenty wiążące antygen (Fab; Rysunek 1) oraz fragmenty Fc, składające się tylko z ciężkich łańcuchów CH2 i CH3., Biochemiczne metody wytwarzania fragmentów przeciwciał wytwarzają przydatne narzędzia do zastosowań diagnostycznych i terapeutycznych, ale jest to dość pracochłonne i wymaga dużej ilości materiału wyjściowego przeciwciała.
fragmenty wiążące antygen wytwarzane przez trawienie biochemiczne obejmują Fab, (Fab')2, Fab' i FV, z których wszystkie nie posiadają regionu Fc. Fragmenty monowalentne F (ab) mają jedno miejsce wiązania antygenów, podczas gdy fragmenty dwuwartościowe (Fab')2 mają dwa regiony wiązania antygenów, które są połączone wiązaniami dwusiarczkowymi., Dwa pojedyncze fragmenty F (ab) są wytwarzane, gdy pełnowymiarowe przeciwciało jest trawione enzymem papainy. Fragment F (ab') 2, który zachowuje część obszaru zawiasu, jest wytwarzany przez trawienie pepsyny przeciwciał IgG lub IgM. Redukcja fragmentów F (ab')2 daje 2 monowalentne fragmenty Fab', które mają wolną grupę sulfhydrylową, która jest przydatna do koniugacji z innymi cząsteczkami. Fragmenty FV są najmniejszym fragmentem powstałym z enzymatycznego rozszczepienia przeciwciał klasy IgG i IgM (ryc. 1)., Fragmenty FV mają miejsce wiązania antygenu wykonane z regionów VH i VL, ale brakuje im stałych regionów Fab (CH1 i CL) (Rysunek 1, prawy panel). VH i VL są utrzymywane razem we fragmentach FV przez interakcje nie kowalencyjne. Fragmenty mogą być generowane za pomocą dostępnych komercyjnie zestawów, na przykład F (ab') 2 Fragmentation Kit z G-Biosciences .,
metody inżynierii genetycznej pozwalają na produkcję pojedynczych łańcuchów zmiennych fragmentów (scFv), które są fragmentami typu FV, które składają się z domen VH i VL połączonych za pomocą zaprojektowanego elastycznego peptydu łączącego (ryc. 1) . Manipulacja orientacją domen V i długości łącznika tworzy różne formy cząsteczek FV . Jeżeli łącznik ma długość co najmniej 12 reszt, fragmenty scFv są głównie monomeryczne (jak pokazano na rysunku 1) ., Linkery, które są 3-11 reszt o długiej wydajności cząsteczek scFv, które nie są w stanie złożyć się w funkcjonalną domenę FV. Cząsteczki te łączą się z drugą cząsteczką scFv, która tworzy dwuwalentną diabodię . Jeśli długość łącznika jest mniejsza niż trzy pozostałości, cząsteczki scFv łączą się w triabody lub tetrabody . Na przykład tao y et al wygenerował diabody VH-VL z krótkim łącznikiem GGGGS i scFv z długim łącznikiem GTTAASGSSGSSSGA ., Wielowalentne scfv posiadają większe powinowactwo do swoich antygenów docelowych w wyniku posiadania dwóch dodatkowych miejsc wiązania antygenu docelowego, co zmniejsza częstość występowania fragmentu przeciwciał . Minibody są białkami fuzyjnymi scFv-CH3, które gromadzą się w dwuwartościowe dimery . Małe fragmenty scFv z dwoma różnymi zmiennymi domenami mogą być generowane w celu wytworzenia fragmentów bis-scFv zdolnych do wiązania dwóch różnych epitopów jednocześnie . Metody genetyczne są również wykorzystywane do tworzenia bispecific Fab dimers (Fab2) i trispecific Fab trimers (Fab3)., Te fragmenty przeciwciał są zdolne do jednoczesnego wiązania 2 lub 3 różnych antygenów, odpowiednio.
oprócz konwencjonalnych przeciwciał, gatunki wielbłądów i rekinów (squalidae) zawierają podgrupę swoistych przeciwciał o ciężkim łańcuchu (hcAb) składających się wyłącznie z homodimerów o ciężkim łańcuchu pozbawionych lekkich łańcuchów . Części Fab tych przeciwciał, zwane VHH u wielbłądów i VNAR u rekinów, są najmniejszymi regionami wiążącymi antygen naturalnie występującymi ., Nanobody są rekombinowanymi domenami pochodzącymi od VHH zdolnymi do wiązania antygenów, często klonowanymi z bibliotek fagowych VHH, takich jak te przeciwko białkom betacoronarivus S. Zbadano ich termodynamikę i struktury wiązania (i odniesienie do nich)., Nanobody są bardzo stabilne i mogą być łatwo produkowane w ogromnej ilości przy użyciu zwykłych prostych systemów ekspresji białek, takich jak bakterie (funkcjonalne konwencjonalne pełnowymiarowe przeciwciała są trudne do wyrażenia prawidłowo w systemie bakteryjnym), co stanowi obiecujące narzędzie do badań i celów terapeutycznych, zwłaszcza w obszarach mikroskopii superrozdzielczej, spektrometrii masowej i ukierunkowanej degradacji białek . Nanobody mogą być również dostarczane wewnątrz żywych komórek poprzez sprzężone z peptydami, lub in vivo, lub wyrażane bezpośrednio in vivo i rozpoznają swoje cele in vivo., Nanobody przeciwko RFP lub GFP, gdy sprzężone z farbami ATTO o dalekiej Czerwieni, osiągnęły 118-krotne powiększenie sygnałów fluorescencyjnych nad GFP lub RFP i były używane do generowania połączeń neuronalnych całego ciała myszy . Zostały one również wykorzystane do stabilizacji stanu aktywnego białek w badaniach strukturalnych . System ekspresji z wieloma połączonymi nanobodami przeciwko różnym szczepom grypy jest badany jako środek do wytworzenia uniwersalnej szczepionki przeciw grypie ., Rekombinowane anty-IgG wtórne nanobody mają wielki potencjał, aby zastąpić powszechnie stosowane poliklonalne wtórne przeciwciała produkowane przy użyciu zwierząt .
Nanobody mają unikalną zdolność przekraczania bariery krew-mózg ; jednak nanobody są bardzo szybko przetwarzane i usuwane z organizmu . Nanobodies mogą używać dla metod jak immunoprecipitation, na przykład, RFP-Trap MA od Chromotek, lub sprzężony fluorescencyjne proteiny śledzić wewnątrzkomórkowe cele w żywych komórkach w czasie rzeczywistym .,
około 10% immunoglobulin bydlęcych zawiera niezwykle długi trzeci łańcuch ciężki komplementarności determinujący region (CDR 3H) z dużą liczbą pozostałości cysteiny . Cysteiny te łączą się w pary tworząc wiązania dwusiarczkowe, które prowadzą do struktury podobnej do łodygi i gałki w domenie wiążącej antygen . Ta wyjątkowo długa domena CDR3H z długą łodygą przyczynia się do różnorodności specyficzności przeciwciał bydlęcych.,
Wewnątrzbłonki lub przeciwciała wewnątrzkomórkowe odnoszą się do przeciwciał lub ich fragmentów (Zwykle o konstrukcji scFv) wyrażonych bezpośrednio wewnątrz komórek lub u zwierząt in vivo za pomocą wektora ekspresji. Na przykład Dong JX et al opracował kilka nanobodies przeciwko białkom neuronalnym dla ekspresji wewnątrzkomórkowej jako wewnątrzbłonków . Jednym z ważnych czynników/zastrzeżeń jest redukujące środowisko wewnątrzkomórkowe, które zmniejsza powinowactwo przeciwciał lub fragmentów przeciwciał, których wiązanie z antygenem jest zależne od wewnątrzkomórkowych wiązań dwusiarczkowych., Inną kwestią jest to, że wewnątrzbłonki mają tendencję do agregacji. Kabayama h i wsp zaprojektowali wewnątrzbrzbiety o ładunku engatywnym netto nawet przy najniższym pH cytoplazmatycznym 6,6, aby wytworzyć ultra stabilne przeciwciała cytoplazmatyczne . Wewnątrzbłonki są stosowane jako alternatywa dla inhibitorów farmakologicznych w celu zwalczania określonych uczestników endocytarnych., W przypadkach ekspresja pojedynczego łańcucha zmiennego fragmentu (scFv) pochodzącego z przeciwciała monoklonalnego 3b12a przeciwko sygnałowi eksportu jądrowego TDP-43 w komórkach HEK293A lub po elektroporacji wektora ekspresji In utero promowała proteolizę agregatów TDP-43 w hodowanych komórkach i embrionalnym mózgu myszy ., Za pośrednictwem wirusa dostarczenie do układu nerwowego przeciwciał scFv przeciwko motywowi rozpoznawania RNA 1 TDP-43 zmniejszonej mikrogliozy w mysim modelu ostrego zapalenia neuroinflacyjnego i łagodzenia zaburzeń poznawczych, wad motorycznych, proteinopatii TDP-43 i neuroinflacji u transgenicznych myszy wykazujących mutacje TDP-43 związane ze stwardnieniem zanikowym bocznym . Potencjał wewnątrzbłonków jako metody terapeutycznej pozostaje do ujawnienia.
fragment przeciwciał może być również połączony ze znacznikiem importu komórek, takim jak znacznik IPTD , aby ułatwić jego wejście do komórek.,
Niwecznik fragmenty oferują pewne zalety nad pełnowymiarowym przeciwciałem dla niektórych zastosowań. Temat został Zrecenzowany przez Nelsona . Jedną z zalet fragmentów nad pełnowymiarowymi przeciwciałami jest to, że fragmenty przeciwciał są mniejsze niż konwencjonalne przeciwciała i generalnie brak glikozylacji, umożliwiając ich produkcję w prokariotycznych systemach ekspresji, które zapewniają oszczędność czasu i kosztów., Dodatkowo fragmenty są na tyle małe, że przenikają do niektórych tkanek, których pełnowymiarowe przeciwciała nie są w stanie przeniknąć, co pomaga w wielu procedurach terapeutycznych i immunohistochemicznych . Ponadto brak domeny Fc jest istotną zaletą dla pierwotnych przeciwciał stosowanych w immunohistochemii i innych zastosowaniach detekcyjnych, ponieważ znacznie zmniejszyły one niespecyficzne wiązanie z receptorem Fc. Jednym z powszechnie stosowanych w diagnostyce scFv jest przeciwciało NC10 przeciwko neuraminidazie grypy., Przeciwciało MOC-31 przeciwko nabłonkowej cząsteczce adhezji komórek Ep – CAM jest scfv powszechnie stosowanym w terapii nowotworowej. Diabodies, triabodies i tetrabodies mają potencjalne zastosowania w zastosowaniach takich jak radioimmunotherapy i diagnostyki obrazowania in vivo . Jednak fragmenty, które nie posiadają domeny Fc ulegają degradacji w organizmie znacznie szybciej niż konwencjonalne przeciwciała i nie są w stanie wywoływać procesów cytotoksycznych za pośrednictwem Fc , chyba że są sprzężone z cząsteczką efektorową, co wymaga dalszej optymalizacji dla terapii opartych na fragmentach przeciwciał.,
chociaż różne fragmenty przeciwciał oferują pewne zalety, nie są one powszechnie wykorzystywane w eksperymentach. W ponad 60 000 artykułów ręcznie kuratorowanych przez Labome tylko kilka artykułów cytowało zastosowania fragmentów Fab przeciwciał. Fragmenty przeciwciał anty-digoksygenin Fab Roche (11093274910) i fragmenty przeciwciał anty-fluorescein Fab ( 11426338910) są wytwarzane u owiec i wytwarzane w wyniku trawienia papainą. Fragmenty Fab anty-digoksygeniny były używane do hybrydyzacji in situ, ponieważ sondy RNA są oznaczone digoksygeniną ., Były one również wykorzystywane do wykonywania analizy fałdowania białek w celu zbadania procesu składania pojedynczej cząsteczki kalmoduliny za pomocą spektroskopii siły pojedynczej cząsteczki. F (ab) fragmenty przeciwciał wtórnych anty-mysich są często używane do blokowania endogennego mysich Ig podczas immunostarzenia, np. affinipure Fab fragment Donkey antimouse IgG z Biozolu (JIM-715-007-003).,
Invitrogen Alexa Fluor 546-skoniugowany kozy anty-królik IgG F(ab')2 fragment został użyty do przeprowadzenia immunohistochemii w celu zbadania roli sFLT-1 w utrzymaniu avascular photoreceptor layer w modelach myszy i Invitrogen Alexa Fluor 488 (Fab')2 fragment królika anty-kozy IgG (H+L) został użyty w immunohistochemii do zbadania mechanizmu regeneracji łączników końcówek w słuchowych komórkach włosowych .,
receptory Fc (FcRs) są cząsteczkami wyrażonymi głównie na / w wrodzonych komórkach immunologicznych, które rozpoznają i wiążą domenę FC przeciwciał i tym samym inicjują odpowiedź immunologiczną opartą na komórkach. Różnorodne funkcje FcRs odzwierciedlają szeroki zakres ochronnych lub modulujących ról przeciwciał, w tym pośredniczących neutralizacji i klirensu docelowych substratów, a także programowania odporności adaptacyjnej ., Funkcje biologiczne FcRs są regulowane przez immunoreceptor tyrozynowe motywy aktywacyjne (ITAMs) i immunoreceptor tyrozynowe motywy hamujące (ITIMs), które działają jako interfejs receptora z aktywującymi i hamującymi szlakami sygnałowymi, odpowiednio. Tak więc sygnalizacja przez ITAMs może wywoływać aktywację komórek, fagocytozę i endocytozę, podczas gdy sygnalizacja przez ITIMs ma hamujący wpływ na aktywację komórek . FCR zostały opisane dla wszystkich klas immunoglobulin, a niektóre z nich zostały omówione poniżej.,
do tej rodziny należą FcyRI, FcyRII, FcyRIII i ich izoformy. Są one odpowiedzialne za cytotoksyczność komórkową zależną od przeciwciał (ADCC) i fagocytozę komórkową zależną od przeciwciał (ACDP) .
innym receptorem wiążącym IgG jest neonatal Fc receptor (FcRn), który bierze udział w przenoszeniu biernej odporności humoralnej z matki na płód. FcRn chroni również IgG przed degradacją in vivo, wyjaśniając ich długi okres półtrwania w surowicy ., Zjawisko to doprowadziło do powstania lepszych przeciwciał terapeutycznych poprzez wprowadzenie zmian w regionie Fc w celu promowania interakcji Fc-FcRn.
obejmują one wysokie powinowactwo FceRI, które jest zdolne do wiązania Monomerycznych IgE, oraz lektynę Fcerii o niskim powinowactwie C, która preferencyjnie oddziałuje ze złożonym IgE. FceRI pośredniczy w natychmiastowej reakcji nadwrażliwości wielu reakcji alergicznych poprzez stymulację degranulacji i uwalnianie szeregu mediatorów zapalnych na komórkach tucznych i bazofilach ., FceRII występuje zarówno w postaci związanej z błoną, która dostarcza sygnał downregulujący dla syntezy IgE , jak i rozpuszczalnych fragmentów, które generują przeciwstawną upregulację na syntezie IgE . Jego rola w transcytozie kompleksów IgE-alergenów w drogach oddechowych człowieka i nabłonku jelitowym jest aktywnie badana jako potencjalny cel alergicznego zapalenia dróg oddechowych w wyniku alergii pokarmowych .
jedyny członek grupy receptorów Iga, FcaRI, ulega ekspresji tylko w komórkach linii mieloidalnej., Odgrywa rolę zarówno w Odpowiedzi pro – jak i przeciwzapalnej w zależności od stanu wiązania IgA. Podczas gdy Wiązanie wydzielniczej IgA (SIgA) obecne w miejscach błon śluzowych ma działanie przeciwzapalne, w tym zapobieganie inwazji patogenów, Wiązanie Iga w surowicy prowadzi do reakcji zapalnych. FcaRI reguluje również żywotność neutrofilów w zależności od mikrośrodowiska zapalnego .
TRIM21 można odróżnić od innych FcRs, ponieważ wykazuje szeroką swoistość przeciwciała. Może wiązać IgG, IgM i IgA . Jest również wyrażany przez komórki większości linii histogennych ., TRIM21 uczestniczy w zależnej od przeciwciał interferencji replikacji wirusa poprzez ukierunkowanie kompleksów cytozolowych wirus-przeciwciało na degradację proteasomalną.
Wiązanie Fc domeny FcRs może mieć niepożądane skutki w monoklonalnych przeciwciał opartych metod analitycznych, takich jak immunohistochemia (IHC), fluorescencja aktywowane komórki sortowania (FACS) i chromatyny immunoprecipitation (ChIP). Niespecyficzne wiązanie z FCR może wprowadzać szum tła, który może prowadzić do wykrycia fałszywych alarmów., Rozwiązania radzenia sobie z tym problemem obejmują wykorzystanie (i) kontroli izotypów do bramkowania, (ii) surowicy w szerokim stopniu konkurować o receptory zaangażowane w niespecyficzne Wiązanie, lub (iii) oczyszczone IgG do blokowania receptorów Fc specyficznie . Innovex Fc Receptor blocker #Nb309 może być stosowany do blokowania parafiny lub zamrożonych sekcji podczas eksperymentów IHC lub IC lub BD Biosciences #553142, blok receptora Miltenyi Biotec Fc Do cytometrii przepływowej. Na przykład, Chopra s i wsp. zablokowali Wiązanie FcyR z 5 µg/ml TruStain fcX (anty-Mouse CD16/32, clone 93) z Biolegendu podczas cytometrii przepływowej i sortowania komórek .,
Dodaj komentarz