średniołańcuchowe kwasy tłuszczowe obniżają poziom cholesterolu w surowicy poprzez redukcję wchłaniania jelitowego kwasu żółciowego u myszy C57BL/6J

zwierzęta i diety

samce myszy C57BL/6 J (w wieku 4 tygodni, n = 80) zostały zakupione w Institute of Laboratory Animal Science, Chińskiej Akademii Nauk Medycznych (licencja nr 1000). SCXK: JING2009–0007) i umieszczony w pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze (22 ± 2 °C, 40% do 60% wilgotności) z 12-godzinnym cyklem światła / ciemności., Komitet Opieki i użytkowania zwierząt chińskiego Szpitala Ogólnego PLA zatwierdził wszystkie procedury eksperymentalne.

myszy karmiono dietą podstawową (dieta AIN-93g, zakupioną w Akademii Wojskowej Nauk Medycznych) w pierwszym tygodniu w celu adaptacji. Dziesięć myszy zostało losowo wybranych i karmionych podstawową dietą jako normalną kontrolą, a pozostałe myszy karmiono dietą bogatą w cholesterol (CR) zmodyfikowaną z diety AIN-96G. Dwa tygodnie później pobrano próbki krwi ze splotu żylnego żuchwy., Myszy z stężeniem TC w surowicy, które były o 2 odchylenia standardowe większe od normy kontrolnej (co stanowiło 67% myszy karmionych dietą CR) losowo przydzielono do trzech grup (n = 12 w każdej grupie). Każda grupa była karmiona inną dietą przez 16 tygodni( Tabela 1): bogate w cholesterol i średniołańcuchowe trójglicerydy (CR-MCT), bogate w cholesterol i długołańcuchowe trójglicerydy (CR-LCT) lub CR. Nisshin Oillio (Tokio, Japonia) przekazał MCTs (C8:0 I C10:0) i LCTs (trójglicerydy długołańcuchowe, olej sojowy). Cholesterol został zakupiony od Sigma-Aldrich (St.Louis, MO, USA)., Beijing Institute of Nutrition Resources (Pekin, Chiny) zmierzył skład kwasów tłuszczowych w dietach CR-MCT i CR-LCT (Tabela 2). Co tydzień monitorowano masę ciała i spożycie pokarmu.,

pobieranie próbek krwi, niedrożności jelit, żółci i kału

pięć myszy zostało wybranych losowo z każdej grupy po 16 tygodniach karmienia, aby zarejestrować spożycie diety i wydalanie kału przy użyciu oddzielnych klatek metabolicznych przez 3 dni., Kały liofilizowano, ważono, sproszkowano i przechowywano w temperaturze − 80 °C do dalszej analizy. Wszystkie myszy były na czczo przez noc (około 12 godzin) przed pobraniem próbek krwi z aorty brzusznej w znieczuleniu (chlorowodorek ksylazyny). Surowicę pobierano po odwirowaniu próbek krwi. Mikrokapsułki zostały wykorzystane do przebicia ściany pęcherzyka żółciowego i ekstrakcji żółci, a każda próbka żółci została odwirowana w 16.000 g przez 30 min. Supernatant zebrano i przechowywano w temperaturze − 80 °C., Tkanki jelita krętego wycięto i przepłukano lodowatym roztworem soli fizjologicznej, a porcje natychmiast przechowywano w temperaturze − 80 °C do dalszej analizy.

pomiary profili lipidowych w surowicy

TC i triglicerydów (TG) w surowicy oznaczono pod koniec eksperymentu przy użyciu zestawów komercyjnych firmy Wako (Osaka, Japonia). Lipoprotein o wysokiej gęstości cholesterolu (HDL-C) i lipoprotein o niskiej gęstości cholesterolu (LDL-C) mierzono metodami osadowymi i zestawem handlowym firmy Abcam (Cambridge, Wielka Brytania). Całkowity kwas żółciowy w surowicy (TBA) został zmierzony przy użyciu komercyjnego zestawu z Blue Gene (Szanghaj, Chiny)., Wszystkie instrukcje producenta były ściśle przestrzegane.

Analiza kwasów żółciowych w kale i żółci przy użyciu HPLC-MS

metody przygotowania i oznaczania kwasów żółciowych w kale i żółci zostały przeprowadzone zgodnie z naszymi wcześniejszymi badaniami i raportami Steiner et al. . Zastosowano wysokowydajny system chromatografii cieczowej Shimadzu LC-20 AD (Shimadzu, Kyoto, Japonia) połączony ze stosowanym spektrometrem masowym BIOSYSTECM 3200 Q ze źródłem jonizacji elektropray (ESI) (Applied Biosystems, Carlsbad, USA). Systemy HPLC i MS były kontrolowane za pomocą Analyst 1.4.,2 software. All chromatographic separations were performed using a Venusil AQ C18 column (2.5 μm, 50 mm × 2.1 mm) (Agela Techonologies, Delaware, USA). Cholic acid (CA), deoxycholic acid (DCA), chenodeoxycholic acid (CDCA), ursodeoxycholic acid (UDCA), lithocholic acid (LCA), taurocholic acid (TCA), taurodeoxycholic acid (TDCA), taurochenodeoxycholic acid (TCDCA), taurolithocholic acid (TLCA), glycocholic acid (GCA), glycodeoxycholic acid (GDCA) and glycochenodeoxycholic acid (GCDCA) were used as standard substances. Chloramphenicol was used as an internal standard., Powyższe materiały zakupiono w Sigma-Aldrich (St.Louis, MO, USA). Pierwotne kwasy żółciowe, w tym CA, CDCA, TCA, TCDCA, GCA i GCDCA oraz wtórne kwasy żółciowe, w tym DCA, LCA, UDCA, TLCA, TDCA i GDCA, w żółci i Kale oznaczano na podstawie czasów retencji.

ilościowe PCR w czasie rzeczywistym (qRT-PCR)

próbki z tkanki jelita cienkiego (około 100 mg) przemyto zimnym PBS i homogenizowano. Całkowity RNA z tkanek i komórek został wyizolowany przy użyciu odczynnika Trizol (Omega Bio-Tek, Norcross, USA, no. R6812). Podkłady zostały zaprojektowane przy użyciu Primer Express 3.,000000000000100000000001000000000010000000000 Metody ekstrakcji RNA i ilościowego real-time PCR (qRT-PCR) zostały opisane w naszych poprzednich publikacjach. qRT-PCR wykonano przy użyciu One Step SYBR® PrimeScript® RT-PCR Kit (Takara Biotechnology Co., Ltd., Dalian, Chiny). Amplifikację przeprowadzono za pomocą termokurczliwego cyklera BIO-RAD Icycler (BIO-RAD, Hercules, CA, USA). Względne poziomy ekspresji mRNA oznaczono metodą porównawczego krytycznego progu (CT) (w osobnej tubie)., Jako środek kontrolny do normalizacji wykorzystano Gen β-aktyny.

Western blot assay

Western blot analizy tkanki jelita cienkiego i hodowanych komórek przeprowadzono zgodnie z opisem przedstawionym wcześniej . Równoważne ilości białka z każdej próbki zostały przygotowane i oddzielone za pomocą SDS-PAGE (12% żeli), a następnie elektrotransfer do membran PVDF., Membrany inkubowano roztworem blokującym (sól fizjologiczna buforowana Tris, 8% suchego mleka beztłuszczowego) przez 2 godziny, a następnie inkubowano ze specyficznymi przeciwciałami w temperaturze 4 °C przez całą noc. Membrany były intensywnie myte w Tbst (tris-bufored Soline with Tween, containing 0,5% Tween-20 in TBS) i inkubowane wtórnymi przeciwciałami sprzężonymi z peroksydazą chrzanu w TBST przez 1 h. membrany były myte dalej w Tbst, a pasma wykrywano za pomocą środków do wykrywania chemiluminescencji. Wykonano densytometrię Blot, a zespoły analizowano za pomocą oprogramowania ImageJ., Przeciwciała skierowane na apical sodium-dependent bile acid transporter( ASBT), ileal bile acid binding protein (i-BABP) i organic solute transporter α/β (Osta/β) zostały zakupione od Abcam (Cambridge, UK). Wtórne przeciwciała przeciwko kozy IgG otrzymano od firmy Sun Biomedical Technology Co. (Pekin, Chiny).

Immunofluorescencja

tkanka jelitowa zamocowana 4% buforowanym paraformaldehydem została osadzona w parafinie i przygotowana o grubości 4 µm. Sekcje były odparafinowane i hartowane w 3% H2O2 przez 15 minut, aby zablokować endogenną peroksydazę., Sekcje przemyto w PBS i inkubowano przeciwciałem anty-i-BABP w PBS (rozcieńczenie 1:50) przez 1 h w temperaturze 37 °C. przeciwciało sprzężone FITC (izotiocyjanian fluoresceiny) dodano w rozcieńczeniu 1:50 i inkubowano przez 0,5 h w temperaturze 37 °C. sekcje przemyto, a pi (jodek propidium) użyto do zabarwienia jąder. I-BABP został sfotografowany przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego (Bx60, Olympus, Ina, Japonia). I-BABP obserwowano jako zieloną fluorescencję, a jądro jako czerwoną fluorescencję .,

kultura komórkowa Caco-2

linia komórkowa Caco-2 została uzyskana z Centrum Zasobów komórkowych, Peking Union Medical College (która jest siedzibą krajowej infrastruktury zasobów komórkowych) w dniu września. 20, 2016. PCR i kultury potwierdziły, że linia komórkowa została sprawdzona wolne od mycoplasma zanieczyszczenia. Geneza tych komórek została potwierdzona za pomocą PCR. Tożsamość linii komórkowej została uwierzytelniona za pomocą profilowania STR (FBI, CODIS). Wszystkie wyniki są dostępne na stronie internetowej (http://cellresource.cn)., Komórki Caco-2 hodowano w zmodyfikowanej pożywce Eagle ' a (Dmem) Dulbecco, zawierającej 10% surowicy bydlęcej płodu (FBS), 1% penicyliny-streptomycyny i 1% nienasyconych aminokwasów. Komórki Caco-2 utrzymywano w temperaturze 37 °C w nawilżonej atmosferze zawierającej 5% CO2 I 95% powietrza. Medium było zmieniane co 2 dni. DMEM, FBS, 1% aminokwasów innych niż niezbędne i inne materiały zostały zakupione z National Infrastructure of Cell Line Resource (Pekin, Chiny) lub Sigma-Aldrich (St.Louis, MO, USA).,

test przepuszczalności kwasu kaprylowego przez monowarstwy komórek Caco-2

dla eksperymentów wchłaniania kwasów żółciowych, odnosząc się do raportu Y. Wang, et al. , komórki były wysiewane i hodowane na wiszących wkładkach komórek Millicell (0,4 µm, Millipore, Molsheim, Francja) przez 21 dni w celu uzyskania zbiegających się i wysoce zróżnicowanych monowarstw komórkowych. Tworzenie funkcjonalnych jednowarstw nabłonkowych monitorowano poprzez pomiar transepitelialnej rezystancji elektrycznej (TEER) przy użyciu miernika Millicell-ERS (Millipore) przed eksperymentami., Morfologię komórek obserwowano za pomocą mikroskopu elektronowego, a przepuszczalność oznaczano za pomocą żółtego Lucyfera (Sigma, MO, USA) jako markera.

przygotowanie kwasów tłuszczowych i CA przeprowadzono zgodnie z opisem X. Zhang i wsp. . Kwasy tłuszczowe i CA oznaczono i rozpuszczono w etanolu, a następnie rozcieńczono pożywką do hodowli komórkowej zawierającą 20 mg/L wolnego od endotoksyn BSA do końcowego stężenia 50, 100 lub 200 µmol/L (Etanol< 0,1%). Rozpuszczone kwasy tłuszczowe i CA inkubowano w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę przed dodaniem do komórek., Kwas kaprylowy (C8: 0), kwas kaprynowy (C10:0), kwas stearynowy (C18:0) i kwas oleinowy (C18:1) zostały zakupione w Sigma-Aldrich (St.Louis, MO, USA).

apical (AP) i basolateral (BL) boki jednowarstwy zostały przemyte zrównoważonym roztworem soli (Hbss) Hanka i wyrównane w wolnym od serum pożywce przez 15 minut. Pożywkę w AP zastąpiono świeżą pożywką zawierającą CA (200 µmol / L) lub zmieszaną z jednym z kwasów tłuszczowych (C8:0, C10:0, C18:0 lub C18:1) przy 50, 100 lub 200 µmol/L., Żywotność komórek Caco – 2 w różnych warunkach oceniano za pomocą testu cytotoksyczności komórek WST-1 (rys. 1). Pożywka z jednym z kwasów tłuszczowych została zdefiniowana jako”grupa C8:0, C10:0, C18:0 lub C18:1″. „Grupa kontrolna” nie zawierała kwasów tłuszczowych, a” grupa ślepa ” nie zawierała CA i kwasów tłuszczowych. W BL zastosowano wyłącznie świeże podłoże. Media ze stron AP i BL zostały usunięte 2 h później i przechowywane do analizy CA przy użyciu HPLC-MS., Pozorna przepuszczalność (Papp) została obliczona przy użyciu następującego równania: Papp = DQ/DT× 1/C0A (dQ to wygląd związku w komorze odbiorczej, dt to czas, C0 to stężenie w komorze dawczej, A A to powierzchnia wkładki).