princípios gerais de transgénese
organismos transgénicos contêm ADN estranho que foi introduzido através da biotecnologia. O DNA estranho (o transgeno) é definido aqui como DNA de outra espécie, ou então DNA recombinante da mesma espécie que foi manipulado no laboratório, então reintroduzido. Os Termos organismo transgênico e organismo geneticamente modificado (OGM) são geralmente sinônimos., O processo de criação de organismos transgênicos ou células para vir organismos inteiros com uma mudança permanente em sua linha germinal tem sido chamado de transformação ou transfecção. (Infelizmente, ambas as palavras têm significados alternativos. A transformação também se refere ao processo de células de mamíferos tornando-se cancerosas, enquanto a transfecção também se refere ao processo de introdução do DNA em células em cultura, seja bacteriana ou eucariota, para um uso Temporário, Não mudanças de linha germinal. Os organismos transgênicos são importantes ferramentas de pesquisa, e são frequentemente usados na exploração da função de um gene., A transgênese também está relacionada com a prática médica da terapia genética, na qual o DNA é transferido para as células de um paciente para tratar a doença. Organismos transgênicos são difundidos na agricultura. Aproximadamente 90% das beterrabas de canola, algodão, milho, soja e açúcar cultivadas na América do Norte São transgênicas. Nenhum outro gado transgênico ou culturas (exceto algumas abóboras, papaias e alfalfa) são atualmente produzidos na América do Norte.
para fazer uma célula transgênica, o DNA deve ser primeiramente transferido através da membrana celular (e, se presente, através da parede celular), sem destruir a célula., Em alguns casos, o DNA nu (que significa plasmídeo ou DNA linear que não está ligado a qualquer tipo de portador) pode ser transferido para a célula adicionando DNA ao meio e aumentando temporariamente a porosidade da membrana, por exemplo por eletroporação. Ao trabalhar com células maiores, o DNA nu também pode ser microinjetado em uma célula usando uma agulha especializada. Outros métodos utilizam vectores para transportar ADN através da membrana. Note que a palavra “vetor” como usada aqui se refere a qualquer tipo de vetor, e não apenas vetores plasmídeos., Vectores para transformação / transfecção incluem vesículas feitas de lípidos ou outros polímeros que rodeiam o ADN; vários tipos de partículas que transportam ADN na sua superfície; e vírus infecciosos e bactérias que transferem naturalmente o seu próprio ADN para uma célula hospedeira, mas que foram concebidas para transferir qualquer molécula de ADN de interesse. Normalmente o DNA estranho é uma unidade de expressão completa que inclui seus próprios reguladores cis (por exemplo, promotor), bem como o gene que deve ser transcrito.quando o objetivo de um experimento é produzir um estável (i.e., eucariote transgénico hereditário, o ADN estranho deve ser incorporado nos cromossomas do hospedeiro. Para que isso ocorra, o DNA estranho deve entrar no núcleo do hospedeiro, e recombinar-se com um dos cromatídeos do hospedeiro. Em algumas espécies, o DNA estranho é inserido em um local aleatório em um cromatídeo, provavelmente onde a quebra da cadeia e a junção final não homóloga ocorre. Em outras espécies, o DNA estranho pode ser direcionado para um locus particular, flanqueando o DNA estranho com DNA homólogo ao DNA do hospedeiro naquele locus., O ADN estranho é então incorporado nos cromossomas do hospedeiro através de recombinação homóloga.para além disso, para produzir organismos multicelulares nos quais todas as células são transgénicas e o transgeno é hereditário, a célula que foi originalmente transformada deve ser um gâmeta ou desenvolver-se em tecidos que produzem gâmetas. Gâmetas transgênicos podem eventualmente ser combinados para produzir descendência homozigótica, transgênica., A presença do transgeno na descendência é tipicamente confirmada usando PCR ou Southern blotting, e a expressão do transgene pode ser medida usando PCR de transcrição reversa (RT-PCR), ARN blotting, e Western (proteína blotting).
a taxa de transcrição de um transgeno é altamente dependente do estado da cromatina em que é inserido (ou seja, efeitos de posição), bem como outros fatores. Portanto, os pesquisadores muitas vezes geram várias linhas transformadas/transfectadas independentemente com o mesmo transgeno, e, em seguida, tela para as linhas com a expressão mais alta., É também uma boa prática clonar e sequenciar o locus transgênico de um organismo transgênico recém-gerado, uma vez que erros (truncações, rearranjos e outras mutações) podem ser introduzidos durante a transformação/transfecção.
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