Anticorpos são imunoglobulinas (Ig) glicoproteínas produzidas por células plasmáticas (células B), em resposta aos estrangeiros moléculas antigênicas (imunógenos). A função primária dos anticorpos é ligar-se especificamente a estes antigénios estranhos para os desactivar e/ou marcar Para destruição pelo sistema imunitário, protegendo assim o hospedeiro da infecção. Existem várias classes de anticorpos., A primeira parte deste resumo foca-se em anticorpos convencionais de tamanho integral, anticorpos de classe IgG e IgM, que são fortemente utilizados em uma infinidade de aplicações biomédicas de pesquisa, diagnóstico e terapêutica.
a unidade básica de um anticorpo convencional é uma unidade de quatro polipeptídeos constituída por duas cadeias pesadas idênticas e duas cadeias leves idênticas mantidas juntas por ligações de dissulfureto. As cadeias leves são mais curtas, com pesos moleculares mais baixos do que as cadeias pesadas., A forma geral de um anticorpo é um Y, com uma região flexível de dobradiças (interdomain) no centro da Y. a flexibilidade da região interdomain é importante para a ligação bivalente de um anticorpo , permitindo que os dois bolsões de ligação interajam com locais antigênicos a distâncias variáveis. Cada cadeia polipeptídica tem uma região constante, que não varia significativamente entre os anticorpos, e uma região variável, que é específica para cada anticorpo particular. A notação comum para a região variável da cadeia de luz é VL e para a região constante da cadeia de luz é CL (Figura 1)., A notação é semelhante para as variáveis de cadeia pesada (VH) e regiões constantes (CH) com CH1, CH2, e CH3 denotando os diferentes domínios de região constante da cadeia pesada. Os hidratos de carbono estão normalmente ligados aos domínios CH2 das cadeias pesadas. A região cristalizável do fragmento (Fc) contém apenas regiões constantes das cadeias pesadas (CH), mas a região de ligação do antigénio do fragmento (Fab) inclui tanto um domínio constante como os domínios variáveis das cadeias pesadas e leves (VH e CL). A região FV da variável fragmento contém apenas os dois domínios variáveis (Figura 1)., Ver anticorpo do rato para discussão sobre os isotipos de imunoglobulina, subclasses e o número de domínios de imunoglobulina.
cada anticorpo completo tem duas bolsas de ligação do antigénio, localizadas nas regiões FV, e pode ligar-se a dois antigénios (ligação bivalente)., No entanto, se os dois antigénios forem demasiado próximos (≤3 nm), ou muito distantes (≥29nm), o anticorpo só se pode ligar a um antigénio (ligação monovalente). Há uma mudança significativa de afinidade entre ligamentos monovalentes e bivalentes com uma mudança 1500 vezes nos valores de Kd .
a estrutura de anticorpos específicos está disponível na Base de dados de anticorpos estruturais (SAbDab), uma base de dados curada de estruturas de anticorpos publicamente disponíveis, bem como ferramentas de modelização estrutural, que é atualizada semanalmente a partir do banco de dados de proteínas (PDB) .,as aplicações convencionais de anticorpos
anticorpos convencionais de tamanho completo têm sido utilizadas na pesquisa para detecção de proteínas através de análises Western blot , imuno-histoquímica e testes imuno-orbitais enzimáticos (ELISA) durante décadas. Anticorpos de tamanho completo também foram desenvolvidos para aplicações de diagnóstico, tais como testes de Gravidez e detecção de bactérias e vírus no sangue, como um ELISA que detecta o HIV. Adicionalmente, os anticorpos convencionais de tamanho completo são usados com frequência em terapeutas de doenças., Por exemplo, Infliximab é um anticorpo de muitos disponíveis que reconhecem o Fator de necrose tumoral alfa (TNFa) e é usado no tratamento da doença de Crohn e artrite reumatóide . Trastuzumab, ou Herceptin, é um anticorpo que se liga ao receptor 2 do factor de crescimento epidérmico e é utilizado no tratamento do cancro da mama metastático . Existem também várias terapêuticas à base de anticorpos, incluindo Muromonab , administradas a receptores de transplante para prevenir a rejeição de transplantes.,embora os anticorpos convencionais de tamanho completo possam ser usados para aplicações terapêuticas, existem vantagens e desvantagens na utilização do anticorpo completo. Uma vantagem importante dos anticorpos convencionais é o fato de que a região Fc engaja a resposta imunitária do organismo, e pode atingir antígenos ligados para a destruição. Esta região Fc também pode ser uma desvantagem em algumas aplicações clínicas, porque a resposta imunitária que normalmente provoca pode ser prejudicial para a saúde do paciente., Além disso, os anticorpos de tamanho completo não podem penetrar bem em certos tecidos devido ao seu tamanho relativamente grande . Em alguns casos, ao usar anticorpos de tamanho completo para aplicações de diagnóstico, o domínio Fc pode causar uma ligação não específica significativa, o que pode prejudicar aplicações de detecção.são preferíveis fragmentos de anticorpos para muitas aplicações. Fragmentos de anticorpos podem ser produzidos através de mecanismos químicos ou genéticos., A fragmentação química utiliza agentes redutores para quebrar as ligações de dissulfeto dentro da região da dobradiça e digestão do anticorpo com proteases incluindo pepsina, papaína e ficina. A construção genética de fragmentos oferece a capacidade de criar uma infinidade de moléculas contendo fragmentos, cada uma com características únicas de ligação e funcionais.
química e digestão da protease de anticorpos IgG ou IgM de tamanho completo produzem fragmentos de ligação ao antigénio (Fab; Figura 1), e fragmentos Fc, constituídos apenas pelos domínios CH2 e CH3 de cadeia pesada., Métodos bioquímicos de geração de fragmentos de anticorpos produzem ferramentas úteis para aplicações diagnósticas e terapêuticas, mas é bastante trabalhoso e requer uma grande quantidade de material de base de anticorpos.
os fragmentos de ligação do antigénio produzidos pela digestão bioquímica incluem Fab, (Fab’)2, Fab’ e FV, todos os quais carecem da região Fc. Os fragmentos monovalentes F (ab) têm um local de ligação do antigénio, enquanto que os fragmentos divalentes (Fab’)2 têm duas regiões de ligação do antigénio que estão ligados por ligações de dissulfeto., Dois fragmentos F(ab) individuais são produzidos quando um anticorpo de tamanho completo é digerido com enzima papaína. Um fragmento F (ab’) 2, que retém uma porção da região da dobradiça, é produzido pela digestão da pepsina de anticorpos IgG ou IgM. A redução de fragmentos de F(ab’)2 produz dois fragmentos de Fab ‘ monovalentes, que têm um grupo sulfidrilo livre que é útil para a conjugação com outras moléculas. Os fragmentos FV são o fragmento mais pequeno produzido a partir da clivagem enzimática de anticorpos da classe IgG e IgM (Figura 1)., Os fragmentos FV têm o local de ligação do antigénio feito das regiões VH e VL, mas faltam as regiões constantes das regiões Fab (CH1 e CL) (Figura 1, painel direito). Os VH e VL são mantidos juntos em fragmentos FV por interações não covalentes. Os fragmentos podem ser gerados através de kits comercialmente disponíveis, por exemplo, F(ab’)2 Kit de fragmentação a partir de G-Biociências .,
métodos de engenharia Genética permitem a produção de cadeia única variável fragmentos (scFv), que são FV tipo de fragmentos que consistem em VH e VL domínios ligados por uma engenharia flexível vinculador peptídeo (Figura 1) . A manipulação da orientação dos domínios V e do comprimento do linker cria diferentes formas de moléculas FV . Quando o linker tem pelo menos 12 resíduos de comprimento, os fragmentos do scFv são principalmente monoméricos (como mostrado na Figura 1) ., Linkers que são 3-11 resíduos de longo prazo produzem moléculas scFv que são incapazes de dobrar em um domínio FV funcional. Estas moléculas associam-se a uma segunda molécula scFv, que cria um diabody bivalente . Se o comprimento do linker for inferior a três resíduos, as moléculas scFv associam-se a triabodies ou tetraborbodies . Por exemplo, Tao Y et al gerou um VH-VL diabody com um linker ggggs curto e scFv com um linker gttaasgssgssga longo ., Os SCFV multivalentes possuem uma maior afinidade de ligação funcional aos seus antigénios alvo, como resultado de terem mais dois locais de ligação do antigénio alvo, o que reduz a taxa de inactividade do fragmento de anticorpo . Os mini-corpos são proteínas de fusão scFv-CH3 que se juntam em dímeros bivalentes . Pequenos fragmentos scFv com dois domínios variáveis diferentes podem ser gerados para produzir fragmentos bispecíficos bis-scFv capazes de ligar dois epitópios diferentes simultaneamente . Os métodos genéticos também são usados para criar dimeros de Fab bispecíficos (Fab2) e aparadores de Fab trispecíficos (Fab3)., Estes fragmentos de anticorpos são capazes de ligar simultaneamente 2 ou 3 antigénios diferentes, respectivamente.para além dos anticorpos convencionais, as espécies de camelídeos e tubarões (squalidae) contêm um subconjunto de anticorpos de cadeia pesada peculiares (hcAb) exclusivamente compostos por homodímeros de cadeia pesada sem cadeias leves . As partes Fab destes anticorpos, chamadas VHH em camelídeos e VNAR em tubarões, são as menores regiões de ligação a antígenos naturalmente encontradas ., Nanorobots São domínios recombinantes derivados da VHH capazes de ligar antígenos, muitas vezes clonados a partir de bibliotecas de FAG de VHH, tais como aqueles contra as proteínas de betacoronarivus . A sua termodinâmica de ligação e estruturas foram estudadas (e referência nela)., Nanobodies são muito estáveis e podem ser facilmente produzidos em grande quantidade por utilizar comum, simples expressão da proteína sistemas, tais como bactérias (funcional convencional de tamanho completo anticorpos são difíceis de expressar corretamente em um bacterianas do sistema), representando uma promissora ferramenta para a pesquisa e para fins terapêuticos, especialmente nas áreas de super-resolução, microscopia, espectrometria de massa, e destina-se a degradação de proteínas . Os nanoorganismos também podem ser administrados dentro das células vivas através de conjugados com peptídeos, ou in vivo, ou expressos diretamente in vivo e reconhecer seus alvos in vivo., Nanoórbios contra o PFR ou GFP, quando conjugados com corantes atto muito vermelhos, atingiram uma ampliação de 118 vezes dos sinais fluorescentes sobre GFP ou RFP, e foram usados para gerar conectividade neuronal de todo o corpo do rato . Eles também foram usados para estabilizar o estado ativo das proteínas em estudos estruturais . Um sistema de expressão com múltiplos nanorobôs concatenados contra diferentes estirpes de gripe está a ser examinado como um meio para gerar uma vacina universal contra a gripe ., Os nanoorganismos secundários anti-IgG recombinantes têm grande potencial para substituir os anticorpos secundários policlonais amplamente utilizados produzidos em animais .os Nano-corpos têm a capacidade única de atravessar a barreira hemato-encefálica ; no entanto, os Nano-corpos tendem a ser processados e eliminados muito rapidamente do corpo . Nanorobôs podem ser usados para métodos como imunoprecipitação, por exemplo , RFP-Trap MA do Chromotek, ou acoplado a proteínas fluorescentes para rastrear alvos intracelulares em células vivas em tempo real .,cerca de 10% das imunoglobulinas bovinas contêm uma terceira região de determinação da complementaridade da cadeia pesada excepcionalmente longa (CDR 3H) com um grande número de resíduos de cisteína . Estas cisteínas formam par para formar ligações de dissulfeto, o que leva a uma estrutura semelhante ao caule e à maçaneta no domínio de ligação do antigénio . Este domínio CDR3H excepcionalmente longo com o caule longo contribui para a diversidade da especificidade de anticorpos bovinos.,
intra-corpos, ou anticorpos intracelulares, referem-se a anticorpos ou seus fragmentos (geralmente de concepção scFv) expressos diretamente dentro das células ou em animais in vivo através de um vetor de expressão. Por exemplo, Dong JX et al desenvolveu vários nanorobôs contra proteínas neuronais para expressão intracelular como intra-corpos . Uma consideração/ressalva importante é o ambiente intracelular redutor que diminui a afinidade de um anticorpo ou fragmento de anticorpo cuja ligação com o antigénio é dependente de ligações intra -domínicas de dissulfureto., Outra consideração é que os intra-corpos tendem a agregar-se. Kabayama h et al concebeu intrabodies com carga Engativa líquida, mesmo com o pH citoplásmico mais baixo 6.6, para gerar anticorpos citoplásmicos ultra-estáveis . Os intra-corpos são utilizados como alternativas aos inibidores farmacológicos para atingir participantes endocíticos específicos., Por exemplo, a expressão de um fragmento variável de cadeia única (scFv) derivado do anticorpo monoclonal 3B12A contra o sinal de exportação nuclear TDP-43 nas células HEK293A ou após a electroporação In utero do seu vector de expressão promoveu a proteólise dos agregados TDP-43 nas células cultivadas e no cérebro embrionário do rato ., Vírus-mediada de entrega para o sistema nervoso de um anticorpo scFv contra o RNA reconhecimento motivo 1 da TDP-43 reduzido microgliosis em um modelo de mouse da aguda neuroinflammation e mitigados comprometimento cognitivo, motor defeitos, TDP-43 proteinopathy, e neuroinflammation em ratos transgênicos expressando TDP-43 mutações ligadas a esclerose lateral amiotrófica . O potencial dos intra-organismos como modalidade terapêutica continua por desenvolver.
Um fragmento de anticorpo também pode ser ligado a uma etiqueta de importação de células, como uma etiqueta IPTD , para facilitar a sua entrada nas células., as aplicações de fragmentos de anticorpos
ragmentos de anticorpos oferecem certas vantagens sobre um anticorpo de tamanho completo para algumas aplicações. Este tópico foi revisto por Nelson . Uma vantagem dos fragmentos sobre os anticorpos de tamanho completo é que os fragmentos de anticorpos são menores do que os anticorpos convencionais e geralmente carecem de glicosilação, permitindo a sua produção em sistemas de expressão procariótica, que proporcionam economia de tempo e custo., Além disso, fragmentos são pequenos o suficiente para se infiltrar em alguns tecidos que anticorpos de tamanho completo são incapazes de penetrar, o que ajuda em muitos procedimentos terapêuticos e imunohistoquímicos . Além disso, a falta de domínio Fc é uma vantagem substancial para anticorpos primários usados em imunohistoquímica e outras aplicações de detecção, porque eles têm reduzido significativamente a ligação não específica ao receptor Fc. Um scFv que é comumente usado em diagnósticos é o anticorpo NC10 contra a neuraminidase da gripe., O anticorpo MOC-31 contra a molécula de adesão de células epiteliais Ep-CAM é um scFv comumente usado como terapia oncológica. Diabodias, triabodias e tetraborcos têm potenciais usos em aplicações como radioimunoterapia e diagnóstico por imagiologia in vivo . No entanto, fragmentos que não possuem o domínio Fc são degradados no corpo muito mais rapidamente do que os anticorpos convencionais , e são incapazes de eliciar processos citotóxicos mediados pelo Fc , a menos que sejam conjugados a uma parte efetora, o que requer uma maior otimização para a terapia baseada em fragmentos de anticorpos., embora vários fragmentos de anticorpos ofereçam certas vantagens, eles não são comumente utilizados em experimentos. Nos mais de 60.000 artigos curados manualmente por Labome apenas alguns artigos citaram aplicações de fragmentos de Fab de anticorpos. Os fragmentos de anticorpos anti-digoxigenina Fab (11093274910) e anti-fluoresceína Fab ( 11426338910) são gerados em ovinos e produzidos por digestão com papaína. Fragmentos de Fab anti-digoxigenina foram usados para hibridizações in situ uma vez que as sondas de RNA são rotuladas com digoxigenina ., Eles também foram usados para realizar análises de dobragem de proteínas para estudar o processo de dobragem de moléculas de calmodulina única através de espectroscopia de força de molécula única . F (ab) fragmentos de anticorpos secundários anti-ratinhos são frequentemente utilizados para bloquear o Ig endógeno do Ratinho durante a imunocentração, por exemplo, o fragmento de Fab de AffiniPure Donkey antimouse IgG do Biozol (JIM-715-007-003) .,
Invitrogen Alexa Fluor 546 conjugado de cabra anti-IgG de coelho F(ab’)2 fragmento foi usado para executar a imunohistoquímica para investigar o papel de sFLT-1 na manutenção do avascular fotorreceptor camada em modelos de mouse e Invitrogen Alexa Fluor 488 (Fab’)2 fragmento de coelho anti-IgG de cabra (H+L) foi utilizado na imunohistoquímica para investigar o mecanismo de sugestão de link de regeneração em células ciliadas auditivas .,receptores Fc
Fc (FcRs) são moléculas expressas principalmente em / em células imunitárias inatas, que reconhecem e ligam o domínio Fc de anticorpos e, assim, iniciam uma resposta imunitária baseada em células. As diversas funções das RFC refletem a ampla gama de funções protetoras ou moduladoras de anticorpos, incluindo a mediação da neutralização e Eliminação de substratos alvo, bem como a programação da imunidade adaptativa ., As funções biológicas das RCF são reguladas por motivos de activação com base na tirosina (ITAMs) e por motivos inibitórios com base na tirosina (ITIMs), que actuam como interface do receptor com as vias de sinalização activadoras e inibitórias, respectivamente. Assim, a sinalização por ITAMs pode provocar activação celular, fagocitose e endocitose, enquanto que a sinalização por ITIMs tem um efeito inibitório na activação celular . As RCF foram descritas para todas as classes de imunoglobulinas e algumas delas são discutidas abaixo.,receptores IgG
esta família inclui FcyRI, FcyRII, FcyRIII e as suas isoformas. São responsáveis pela citotoxicidade (ADCC) mediada por células dependentes de anticorpos e pela fagocitose (ACDP) mediada por células dependentes de anticorpos .
outro receptor que se liga à IgG é o receptor Fc neonatal (FcRn), que está envolvido na transferência da imunidade humoral passiva de uma mãe para o feto. A FcRn também protege a IgG da degradação in vivo, explicando a sua longa semi-vida sérica ., Este fenômeno levou ao desenvolvimento de melhores anticorpos terapêuticos, introduzindo alterações na região Fc para promover a interação Fc-FcRn.os receptores de IgE incluem a elevada afinidade FceRI, que é capaz de ligar a IgE monomérica, e a baixa afinidade C-Tipo lectin FceRII, que interage preferencialmente com IgE complexa. A FceRI mediata a resposta imediata de hipersensibilidade de muitas reacções alérgicas, estimulando a degranulação e a libertação de uma série de mediadores inflamatórios em mastócitos e basófilos ., FceRII existe tanto em uma forma de membrana que fornece um sinal de desregulação para a síntese de IgE, bem como fragmentos solúveis que geram uma regulação oposta sobre a síntese de IgE . O seu papel na transcitose de complexos alergénicos IgE nas vias aéreas humanas e no epitélio intestinal está a ser activamente investigado como um alvo potencial para inflamação das vias aéreas alérgicas como resultado de alergias alimentares .
o único membro do grupo receptor IgA, FcaRI, é expresso apenas em células da linhagem mielóide., Desempenha um papel tanto nas Respostas pró-como anti-inflamatórias, dependendo do estado da ligação IgA. Embora a ligação da IgA secreta (SIgA) presente nos locais das mucosas tenha efeitos anti-inflamatórios, incluindo a prevenção da invasão de agentes patogénicos, a ligação da IgA sérica leva a respostas inflamatórias. A FcaRI também regula a viabilidade dos neutrófilos, dependendo do microambiente inflamatório .
TRIM21 pode ser distinguido de outras RCF, uma vez que mostra uma ampla especificidade de anticorpos. Pode ligar IgG, IgM e IgA . É também expressa por células da maioria das linhagens histogénicas ., O TRIM21 participa na interferência mediada por anticorpos da replicação viral, visando complexos citosólicos vírus-anticorpos para a degradação proteosómica.a ligação Fc dos domínios Fc às RCF pode ter efeitos indesejáveis em métodos analíticos monoclonais baseados em anticorpos, tais como imunohistoquímica (IHC), triagem celular activada por fluorescência (FACS) e imunoprecipitação cromatina (ChIP). A ligação não específica às RFC pode introduzir ruído de fundo que pode levar à detecção de falsos positivos., As soluções para lidar com este problema incluem o uso de (I) controles isotipos para gating, (II) soro para competir amplamente pelos receptores envolvidos na ligação não específica, ou (iii) IgG purificada para bloquear os receptores Fc especificamente . Innovex Fc Receptor blocker #NB309 pode ser usado para bloquear secções parafínicas ou congeladas durante experiências IHC ou IC ou Biosciências BD #553142, Miltenyi Biotec Fc receptor block para Citometria de fluxo. Por exemplo, Chopra s e al bloquearam a ligação da FcyR com 5 µg/ml de TruStain fcX (CD16/32 anti-rato, clone 93) de BioLegend durante a citometria de fluxo e a triagem celular .,
Dr. Macarena Fritz Kelly de São José dos Campos, SP, Brasil, contribuiu com a seção sobre receptores Fc em setembro de 2018.
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