as proteínas de membrana Integral

as proteínas de membrana Integral

as proteínas de membrana Integral (Pim) actuam como gateways para as células. Todas as células e organelas estão envoltas numa camada lipídica impermeável e os Pim que estudamos estão incorporados nestas membranas. Eles são as rotas de entrada e saída para muitos íons, nutrientes, resíduos de produtos, hormônios, drogas e grandes moléculas, tais como proteínas e DNA. São também responsáveis por grande parte da comunicação entre as células e o seu ambiente., As células podem fazer uma grande variedade dessas proteínas, aproximadamente 30% dos genes no código do genoma humano para proteínas de membrana, e no entanto sabemos relativamente pouco sobre essas moléculas.as proteínas de membrana são, infelizmente, notoriamente difíceis de manusear e estudar, uma vez que são concebidas para se sentarem dentro do ambiente hidrofóbico da camada intermédia lipídica. Eles tendem a ser instáveis quando extraídos de seu ambiente nativo e temos que adicionar detergentes para cobrir a superfície hidrofóbica., Para compreender e controlar a função destas proteínas é essencial ter informação sobre a sua estrutura tridimensional, que é geralmente obtida por cristalografia de raios X. No entanto, a dificuldade de manipulação destas proteínas tornou difícil a resolução das estruturas, e até à data existem menos de 300 estruturas de proteínas de membrana conhecidas, menos de 0,5% de todas as estruturas conhecidas. Para os eucariotas superiores, a história é ainda mais dura, com apenas 20 estruturas de Pim humanos e menos de 50 Pim de mamíferos resolvidos., As proteínas de membrana são, portanto, uma das mais importantes fronteiras remanescentes da pesquisa biológica estrutural. No SGC estamos agora a aplicar os nossos mais avançados métodos de alta produção para superar os estrangulamentos na pesquisa de proteínas de membrana, para que possamos fornecer amostras e estruturas de proteínas de membrana puras destas moléculas fascinantes e clinicamente críticas.a importância médica desta enorme família de proteínas não pode ser sobrestimada., Mutações em proteínas membranares estão envolvidas em muitas doenças comuns, incluindo doenças cardíacas, onde canais iônicos defeituosos são muitas vezes implicados. Os medicamentos destinados aos canais de cálcio podem controlar questões como a pressão arterial elevada e a angina. As proteínas de membrana estão envolvidas no cancro, onde erros nas vias de sinalização podem levar a que as células se dividam fora de controlo. Muitas vezes, as proteínas de membrana específicas são superproduzidas em células cancerígenas e, portanto, são alvos da terapia medicamentosa. Doenças do cérebro como enxaqueca, depressão e Alzheimer estão todas ligadas a problemas com os transportadores e canais., A fibrose cística é causada por mutações no gene regulador de condutância transmembranar da fibrose cística (CFTR) que codifica um canal iônico de cloreto.uma vez que muitas proteínas de membrana se encontram à superfície das células, estão prontamente disponíveis para pequenas moléculas que circulam no sangue. Não é, portanto, surpreendente que mais de 50% das pequenas moléculas se liguem às proteínas da membrana. Os receptores e canais acoplados à proteína G são particularmente importantes a este respeito, mas os transportadores ABC e os portadores de soluto também são alvos da terapia medicamentosa., A nossa compreensão de muitas outras doenças e a nossa capacidade de tratar estas doenças beneficiariam muito com informações mais estruturais e funcionais sobre as proteínas envolvidas. Esperamos que, resolvendo as estruturas dessas proteínas, compreendendo a bioquímica subjacente e as interações com substratos e inibidores, possamos fornecer tratamentos mais eficazes para muitas doenças.

A SGC e as proteínas integrais da membrana

a SGC tem uma vasta experiência na resolução de estruturas de proteínas humanas solúveis utilizando sistemas de alta capacidade altamente eficientes., Nos últimos dois anos adaptamos estes métodos para resolver estruturas para proteínas da membrana humana. Nós rastreamos 186 proteínas de membrana humana de diversas famílias, selecionando uma série de construções para cada proteína, identificando detergentes adequados para purificação e, em seguida, aumentando o purificaiton e cristalizando essas proteínas. Nós cristalizamos 3 proteínas de membrana e resolvemos nossa primeira estrutura, um processo que levou menos de dois anos do primeiro clone à estrutura.,resolvemos a primeira estrutura de um transportador ABC humano, uma classe de proteínas que estão envolvidas no transporte de moléculas pequenas, resistência a múltiplos fármacos e doenças como fibrose cística e diabetes. Nosso primeiro alvo bem sucedido é o transportador ABC mitocondrial humano, ABCB10, que está incorporado na membrana interna da mitocôndria. O ABCB10 é sobre-expresso durante a diferenciação eritrocitária, o processo que forma os glóbulos vermelhos. é sobreexpressed na medula óssea, no coração e no fígado., Há agora evidências de que quando a expressão ABCB10 é reduzida nas células, elas são mais suscetíveis a estresse oxidativo e que ABCB10 pode estar envolvido na proteção do coração durante um ataque cardíaco.

tecnologias para o estudo dos Pim

estamos a desenvolver métodos genéricos que permitem a determinação do elevado débito das estruturas das proteínas da membrana humana. Selecionamos o sistema de expressão de células de baculovírus/inseto que fornece uma composição lipídica próxima à das células humanas e é uma plataforma de alta capacidade comprovada., Para cada proteína alvo, nós geramos uma série de construções de comprimento variável e diferentes marcas de afinidade, incluindo o gene de comprimento completo e uma série de truncações para remover regiões potencialmente desordenadas. Uma tela de expressão de alta capacidade é usada para identificar proteínas que podem ser usadas para purificar quantidades miligramas de PIM para cristalização. Cada proteína é inicialmente purificada em detergente dodecil maltosido (DDM) e é subsequentemente rastreada para obter estabilidade numa série de diferentes detergentes, a fim de identificar as condições ideais para a estabilidade e cristalização.,estabelecemos métodos para cristalização e manipulação de cristais frágeis de proteínas de membrana de elevada capacidade de nanodrope. Desenvolvemos sistemas eficientes para rastreamento de cristais de proteína de membrana para a qualidade da difração como um método para a otimização de conditons de cristalização. Nós também otimizamos nossa coleta de dados e análise de dados de difração usando microfocus synchrotron intenso beamlines, disponíveis em recursos como Diamond Light Source Ltd, em Oxfordshire., Sempre que possível, a cristalização é realizada com ligantes e inibidores ligados para capturar uma única conformação nativa e fornecer informações fundamentais sobre a função e o design de drogas. Também planejamos gerar fragmentos de anticorpos contra nossas proteínas purificadas para uso como reagentes de afinidade e auxiliares de cristalização.