Evolução do fundo do Mar Gulper Enguia Genomas Mitocondriais: larga Escala de Genes Rearranjos Originou Dentro de Enguias

Resumo

estudos Recentes têm demonstrado que os desvios da típica de vertebrados do gene mitocondrial ordem são mais freqüentes do que inicialmente se pensava., Tais desvios, entretanto, são menores, com inversões e/ou translocações de alguns genes sendo envolvidos e duplicação tandem das regiões do gene seguido por deleções de genes tendo sido invocados como mecanismos originados em tal nova ordem do gene., Durante o curso de filogenética molecular estudos sobre o Elopomorpha (enguias e seus aliados), descobrimos que os genomas mitocondriais (mitogenomes) a partir de dois em mar profundo gulper enguias, Eurypharynx pelecanoides (Eurypharyngidae) e Saccopharynx lavenbergi (Saccopharyngidae), apresentam um gene idêntico fim de que muito difere do que qualquer outros vertebrados. A análise filogenética utilizando os dados mitogenómicos de 59 espécies de peixes não só confirmou uma única origem de tal ordem genética com confiança, como também indicou que tinha sido derivada da ordem típica dos genes vertebrados., Comparações detalhadas das gulper gene de enguia com a ordem típica de vertebrados sugeriu que a ocorrência de um único passo, de grande escala, a duplicação do gene região que se estende >12 kb, seguido por deleções de genes em um ancestral comum das duas espécies, mais parcimoniosamente contas para este incomum gene arranjo.

introdução

ordem do gene mitocondrial em vertebrados foi inicialmente considerada conservadora porque as sequências nucleotídicas completas dos genomas mitocondriais (mitogenomas) de mamíferos (Anderson et al. 1981, 1982; Bibb et al., 1981) and the African clawed frog (Roe et al. 1985) mostrou uma ordem genética comum. Como as sequências completas de DNA mitocondrial (mtDNA) foram determinadas para um número de vertebrados (269 espécies a partir de 11 de junho de 2003; National Center for Biotechnology Information Web site: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PMGifs/Genomes/7742.html), foi reconhecido que os desvios da ordem genética típica não são tão raros nos vertebrados (Fig. 1; Boore 1999). Com exceção de mamíferos placentários, exemplos incluem todas as linhagens principais de vertebrados como lampreys (Lee e Kocher 1995), anfíbios (Macey et al. 1997; Sumida et al., 2001), reptiles (Kumazawa and Nishida 1995; Quinn and Mindell 1996; Macey et al. 1997), birds (Desjardins and Morais 1990, 1991; Quinn and Wilson 1993; Mindell, Sorenson, and Dimcheff 1998), marsupials (Pääbo et al. 1991; Janke et al. 1994), e fish (Miya e Nishida 1999; Inoue et al. 2001b; Miya, Kawaguchi, and Nishida 2001). Tais rearranjos de genes, no entanto, são locais (mais notavelmente dentro de um conjunto de genes tRNA), e nenhum exemplo foi encontrado que envolve rearranjos de escala genômica.,

Gulper enguias são bem conhecidos criaturas do mar profundo, coletivamente, incluindo quatro famílias colocado na ordem Saccopharyngiformes, que ocorrem em bathypelagic profundidade (>1.000 m) em todo o mundo oceanos (Bertelsen, Nielsen e Smith, 1989). Sua aparência bizarra (Fig. 1), que resulta de paisagens extremamente dilatadas e Deformadas na ponta da cabeça e do corpo da enguia, tem atraído muita atenção de muitos pesquisadores (por exemplo, Bertelsen, Nielsen e Smith 1989; Robins 1989)., Especializada características anatômicas têm levado os pesquisadores a supor que o filogenética posições desses animais estão fora de peixes ósseos (por exemplo, Tchernavin 1946), embora eles geralmente têm sido considerados parentes próximos do verdadeiro enguias (ordem Anguilliformes), porque eles têm uma folha-como leptocephalous fase de larva (Greenwood et al. 1966; Inoue and Miya 2001).,durante o curso dos estudos filogenéticos moleculares do Elopomorpha (ENE e seus aliados) usando dados mitogenômicos, encontramos uma ordem genética mitocondrial incomum para um dos enguia gulper, Eurypharynx pelecanoides (Fig. 1). Este artigo descreve a nova organização genética nos mitogenomas de duas espécies de enguias gulper, E. pelecanoides e Saccopharynx lavenbergi. Empregamos uma abordagem baseada na reação em cadeia da polimerase (PCR) desenvolvida por Miya e Nishida (1999) para sequenciar os mitogenomas completos destes peixes., Para explorar a origem desses mitogenomas únicos, submetemos os dados mitogenômicos à análise filogenética, e discutimos aqui os possíveis mecanismos que geram tal arranjo genético nas duas enguias gulper.materiais e métodos

amostras

sequências de ADN mitocondrial foram obtidas a partir de seis indivíduos de duas espécies que representam duas famílias da ordem Saccofaringiformes (Robins 1989). Para a família eurypharyngidae, um indivíduo de E., pelecanoides foi usado como um espécime para a determinação da sequência completa do mtDNA, e os outros quatro indivíduos, incluindo duas larvas leptocéfalas, foram usados para a determinação de sequências parciais de quatro junções principais do gene (Fig. 2) para confirmar a ordem genética no mitogenome E. pelecanoides. Para a família Saccopharyngidae, um único indivíduo de S. lavenbergi foi usado como um espécime para a determinação da sequência completa mtDNA., Exsicatas foram depositadas no peixe coleções do Museu de História Natural & Instituto, Chiba, Japão (CBM-ZF), e na Universidade de Washington (UW): E. pelecanoides (CBM-ZF 10311: Hyuga-Nada, sul do Japão; CBM-ZF 10312, 10313, 10316, e 10317: equatorial central do Oceano Pacífico) e S. lavenbergi (UW 045633: Pacífico Oriental).extracção de ADN uma porção da musculatura epaxial (ca. 0, 25 g) foi extraído de espécimes frescos de cada espécie e imediatamente conservado em etanol a 99,5%., O ADN genómico Total foi extraído utilizando o kit de tecido Qiagen QIAamp, seguindo o protocolo do fabricante.

reacção em cadeia da polimerase e sequenciação

os mitogenomas inteiros de duas enguias gulper foram amplificados usando uma técnica de PCR longa (Cheng, Higuchi e Stoneking 1994). Cinco peixes-universal, e três espécies específicas de long-PCR primer (S-LA-16S-L + H12293-Leu e L12321-Leu + S-LA-16S-H para E. pelecanoides; L2508–16S + Sala-nd4 não-H e Sala-CO1-L + Sala-ND1-H para S. lavenbergi; fig. 1) foram utilizados para amplificar todo o mitogenoma de cada enguia em duas reacções., Os mitogenomas inteiros dos outros quatro indivíduos de E. pelecanoides foram amplificados com três primers universais de peixes e um primer long-PCR específico de uma espécie (L2508-16S + Eupe-ND2-H E L12321-Leu + S-LA-16S-H). Quatro espécies de primers específicos (Eupe-ND2-H para E. pelecanoides; Sala-CO1-L, Sala-ND1-H, e Sala-nd4 não-H para S. lavenbergi) foram, em alternativa, concebidos com referência ao parcial de sequências nucleotídicas da ND2 de genes de E. pelecanoides e o COI, ND1, e nd4 não genes de S. lavenbergi determinada a partir de cada total de DNA usando peixe-universal primários.,

O longa-produtos de PCR foram diluídos com a TE buffer (1:20) para posterior utilização de PCR modelos, exceto para uma região intervir entre os dois longas-PCR primer (S-LA-16S-H e S-LA-16S-L, e H12293-Leu e L12321-Leu para E. pelecanoides; fig. 1), no qual o DNA genômico total foi usado alternativamente.

a total of 82 fish-universal primers (Miya and Nishida 1999, 2000; Inoue et al., 2000, 2001a, 2001b, 2001c, 2001d; Ishiguro, Miya, e Nishida 2001; Kawaguchi, Miya, e Nishida 2001) foram usados em várias combinações para amplificar segmentos contíguos e sobrepostos de todo o mitogenome para cada uma das duas espécies. Os primeros específicos das espécies foram concebidos nos casos em que não estavam disponíveis primadores universais dos peixes adequados. Uma lista de iniciadores PCR usados para uma espécie específica está disponível a partir de J. G. I. A pedido. As reações de PCR longas e subsequentes foram realizadas como descrito anteriormente (por exemplo, Miya e Nishida 1999; Inoue et al. 2003).,

produtos de PCR de cadeia dupla, purificados utilizando um Kit de pré-sequenciação (USB), foram subsequentemente utilizados para sequenciação de ciclos diretos utilizando terminadores marcados com corantes (“Applied Biosystems”). Os iniciadores usados eram os mesmos que os utilizados para PCR. Todas as reacções sequenciadas foram realizadas de acordo com as instruções do fabricante. Fragmentos rotulados foram analisados por meio de um sequenciador de DNA modelo 377 (Biosystems aplicados).

A análise de sequências

as sequências de ADN foram analisadas usando o programa DNASIS de software de computador Versão 3.2 (Engenharia de Software Hitachi)., As localizações dos 13 genes codificadores de proteínas foram determinadas por comparações de sequências de ADN ou aminoácidos de mitogenomas de peixes ósseos. Os 22 genes tRNA foram identificados pelas suas estruturas secundárias de cloverleaf (Kumazawa e Nishida 1993) e sequências de anticodon. Os dois genes rRNA foram identificados por similaridade de sequência e estrutura secundária (Gutell, Gray e Schnare 1993). Os dados de sequência estão disponíveis no DDBJ / EMBL / GenBank com os números de adesão AB046473 e AB046475–AB046490 para E. pelecanoides e AB047825 para S. lavenbergi.,

análise filogenética

as matrizes de dados de Inoue et al. (2001d) e Miya, Kawaguchi e Nishida (2001) foram combinados e táxons redundantes foram eliminados. Sequências mitogenómicas das duas enguias gulper e dois teleostes (Gymnothorax kidako, AP002976 e Salmo salar, U12143 ) foram adicionadas. Uma vez que alinhamentos inequívocos dos dois genes rRNA com base em modelos de estrutura secundária não eram viáveis (Miya e Nishida 2000), eles não foram usados nas análises., O gene ND6 não foi usado nas análises filogenéticas por causa de sua composição de base heterogênea e desempenho filogenético consistentemente fraco (por exemplo, Zardoya e Meyer 1996; Miya e Nishida 2000). Também, os laços tRNA, tRNASer (AGY) (estruturas secundárias inferidas instáveis em algumas espécies), e outras regiões ambíguas alinhadas, como as extremidades 5′ e 3′ de vários genes codificadores de proteínas, foram excluídos das análises., Além disso, as posições do 3º codão nos genes codificadores de proteínas que poderiam induzir positivamente em erro uma análise das relações de alto nível dos actinopterígios (Miya e Nishida 2000) foram excluídas das análises, deixando 7.984 posições nucleótidas disponíveis a partir dos 12 genes codificadores de proteínas e 21 genes tRNA.

Bayesian phylogenetic analyses were conducted using MrBayes 2.01 (Huelsenbeck and Ronquist 2001)., O modelo reversível de tempo geral com alguns sites considerados invariáveis e com sites variáveis assumidos para seguir uma distribuição de gama discreta (GTR + i + Γ; Yang 1994) foi selecionado como o modelo mais adequado de substituição de nucleótidos (ModelTest Versão 3.06; Posada e Crandall 1998). Nós definimos os parâmetros de probabilidade máxima em MrBayes como segue:” lset nst = 6 “(GTR),” rates = invgamma “(i + Γ), e” basefreq = estimate ” (proporção estimada dos tipos de base a partir dos dados). O processo de Monte Carlo de Markov foi definido para que quatro cadeias (três aquecidas e uma fria) funcionassem simultaneamente., Realizamos duas corridas independentes por 1 milhão de gerações, com árvores sendo amostradas a cada 100 gerações, cada uma delas partindo de uma árvore aleatória. Duas análises independentes convergiram em pontuações semelhantes de log-likelihood e atingiram “stationarity” (falta de melhoria nas pontuações do ML) em até 120 mil gerações., Assim, as primeiras 1.200 árvores foram descartadas de cada análise, e as restantes 17.602 amostras combinadas de duas análises independentes foram usadas para gerar uma árvore de consenso de regra de 50%, com a porcentagem de amostras recuperando qualquer clado em particular representando a probabilidade posterior desse clado (Huelsenbeck e Ronquist 2001).

resultados

organizações do genoma

os comprimentos totais dos mitogenomas de E. pelecanoides E S. lavenbergi são 18,978 bp e 18,495 bp (excepto para uma porção da região de controlo putativo para S., lavenbergi), respectivamente (ver material suplementar em linha). O conteúdo do genoma destas duas enguias gulper inclui dois rRNA, 22 tRNA e 13 genes codificadores de proteínas, como Encontrados em outros vertebrados (Fig. 2). Também como em outros vertebrados, a maioria dos genes destas duas espécies são codificados na H-strand, exceto para os genes ND6 e oito tRNA. Todas as características são semelhantes em comprimento às de outros peixes ósseos, com excepção do gene COI e da região de controlo para E. pelecanoides e dos genes COI e cyt B Para S., lavenbergi (aproximadamente 100, 800, 150, e 30 bp mais longo do que os de outros peixes ósseos, respectivamente).o e. pelecanoides mitogenome contém três regiões não codificadas com mais de 200 bp (Fig. 2; Ver também materiais suplementares em linha; região não codificada e região de controlo ). O nc1, localizado entre os genes TRNASER (UCN) e tRNAAsp, e o nc2, localizado entre os genes tRNAAsp e COII, contém dois e quatro pseudogenes correspondentes a cópias degeneradoras do gene tRNAAsp, respectivamente., Uma região sem códigos (1.818 bp) localizada entre os genes cyt b e tRNAPhe parece corresponder à região de controlo. O mitogenome S. lavenbergi também contém três regiões não codificadas com mais de 200 bp (regiões não codificadas e regiões de controlo ). O nc, localizado entre os genes tRNALeu(CUN) e ND5, contém pelo menos dois pseudogenes correspondentes a cópias degenerativas do gene tRNALeu(CUN)., CR1 (992 bp), localizado entre duas gene tRNA clusters (TP e IM regiões), e CR2 (> 837 bp), localizado entre cyt b e tRNAPhe genes, parecem corresponder à região de controle, e eles têm completamente idênticos sequências de mais de 800 pb, indicando que eles são submetidos a evolução concertada (ver Kumazawa et al. 1998).

com excepção das duas regiões de controlo duplicadas (CR1 e CR2) no mitogenoma de S. lavenbergi, os mitogenomas das duas enguias gulper de alto mar apresentam uma ordem genética idêntica (Fig. 2)., No entanto, a ordem genética mitocondrial das duas enguias gulper difere muito da de todos os outros vertebrados conhecidos até à data. Quando alguns genes tRNA foram excluídos das comparações(Fig. 2), identificamos cinco gene blocos (A, tRNAGlu–tRNAGln; B, ATP8-ND3; C, tRNALeu(CUN)–ND6; D, tRNAIle–tRNALys; e, tRNAArg–tRNASer(AHA) regiões do gene), o gene da ordem do que é idêntico ao típica de vertebrados.,

Filogenética Posições de Dois Gulper Enguias

a Figura 3 é 50% de regra da maioria árvore de consenso de 17,602 combinado amostras de dois independentes Bayesiana análises dos 59 mitocondrial sequências nucleotídicas da concatenado 12 codificadores de proteínas (sem 3ª posições dos códons), além de 21 genes tRNA (tronco regiões só) usando o GTR + I + Γ modelo de seqüência de evolução (Yang, 1994). Com a exceção de alguns nós dentro do Neoteleostei, a maioria dos ramos internos foram suportados por altas probabilidades posteriores Bayesianas (≥95%)., Deve ser destacado que a resultante da árvore explicitamente demonstra não apenas que os dois gulper enguias formar uma irmã-grupo de relacionamento com uma alta probabilidade posterior (100%), mas também que eles são profundamente aninhados dentro da Anguilliformes (verdadeiro enguias), sugerindo fortemente que eles foram obtidos a partir de uma enguia-como ancestral.

discussão

recentemente, foram determinadas mais de 140 sequências completas de mtDNA dos peixes actinopterígios (por exemplo, Miya e Nishida 1999, 2000; Inoue et al., 2000, 2001a, 2001b, 2001c, 2001d, 2003; Ishiguro, Miya, and Nishida 2001, 2003; Kawaguchi, Miya, and Nishida 2001; Miya, Kawaguchi, and Nishida 2001; Miya et al. 2003; Saitoh et al. 2003), e vários exemplos de rearranjos de genes foram relatados (Fig. 1). Note-se que tais eventos de rearranjo de genes envolvem poucos genes e que o arranjo genético dos mitogenomas de gulper eel difere muito do de outros vertebrados.,

implicações filogenéticas sobre a origem da nova ordem genética

para deduzir a evolução dos arranjos genéticos nas duas enguias gulper, inferência para a organização ancestral baseada em um quadro filogenético confiável é necessária. Embora as enguias gulper tenham sido incluídas no Elopomorpha baseado apenas em uma forma de larva pelágica distinta, denominada leptocéfalo, ninguém corroborou sua posição filogenética usando matrizes de caracteres derivadas de dados morfológicos ou moleculares (Inoue e Miya 2001).,análise bayesiana utilizando os dados mitogenómicos de 59 espécies que representam a diversidade teleosteana dos peixes (Fig. 3) não só corroborou que a nova ordem genética das duas enguias gulper teve origem num ancestral comum das duas espécies, mas também demonstrou que a sua origem era independente das outras ordens genéticas novas. Também parece que a nova ordem genética de Conger myriaster, outro membro do Elopomorpha, tem uma origem independente da de gulper eels., Note-se que Anguilla japonica, que tem a ordem típica dos genes vertebrados, foi colocada com confiança como uma espécie irmã das duas enguias gulper. A reconstrução mais parsimónica dos eventos de rearranjo genético na árvore filogenética indicou que a ordem genética aberrante dos dois enguias gulper é derivada da dos vertebrados típicos.

mecanismo possível para o rearranjo do Gene em enguias Gulper

dois mecanismos principais foram propostos para explicar os rearranjos do gene em mitogenomas vertebrados (Lee e Kocher 1995; Kumazawa et al. 1996)., Uma delas é a duplicação em tandem das regiões de genes, como resultado do erro da linha escorregadia, seguida das supressões de genes (Moritz e Brown 1986; Levinson e Gutman 1987). Embora a dinâmica dos arranjos do gene mitocondrial não tenha sido explicada em alguns invertebrados (por exemplo, Kurabayashi e Ueshima 2000; Machida et al. 2002; Tomita et al. 2002), rearranjos de genes mitocondriais vertebrados podem ser explicados por tal mecanismo (Desjardinas e Morais 1990; Quinn e Wilson 1993; Kumazawa e Nishida 1995; Kumazawa et al., 1996; Mindell, Sorenson, and Dimcheff 1998; Miya and Nishida 1999; Inoue et al. 2001b), e sua viabilidade também é apoiada pelas duplicações polimórficas frequentes de sequências mtDNA (por exemplo, Stanton et al. 1994; Gach and Brown 1997; Mindell, Sorenson, and Dimcheff 1998; Miya and Nishida 1999). Os outros mecanismos sugeridos invocam a preparação ilícita da replicação pela tRNAs e a integração resultante dos genes tRNA na região de controlo (Cantatore et al. 1987; Jacobs et al. 1989).,

embora o segundo modelo não seja excluído neste ponto, o primeiro modelo é favorecido como o mecanismo de rearranjo de genes nos mitogenomas de gulper eel. Assumindo que um fragmento de DNA longo na região tRNAIle–CR da organização típica é duplicado (Fig. 4), supressões subsequentes de genes redundantes daria origem à organização de genes rearranjados em enguias gulper. Tais duplicações em tandem e supressões subsequentes, a maioria parsimoniosamente resultaram na ordem genética observada e espaçadores intergênicos associados nestas duas enguias gulper.,as supressões múltiplas de genes redundantes pareciam estar incompletas nas duas enguias gulper, devido a vários troços de sequências não codificadas (Fig. 2) ocorrendo em torno dos genes envolvidos no rearranjo (Fig. 4). Embora nc1 e nc2 em E. pelecanoides e nc em S. lavenbergi são compostas de repetitivos pseudogenes correspondente a degeneração cópias do adjacentes gene tRNA, CR1 e CR2 em S. lavenbergi mitogenome idênticos sequências de mais de 800 bp, e CR1 está localizado no suposto duplicado posição enquanto CR2 está localizado na posição original da região de controle., Esta observação no mitogenome S. lavenbergi suporta o conceito de duplicação tandem e subsequentes eventos de eliminação como tendo ocorrido na região tRNAIle–CR (Fig. 4).

Se quatro dos cinco contíguos gene blocos foram duplicados juntos em um ancestral comum das duas espécies, e, se posterior eliminação de genes ocorreu antes de especiação, o assumido duplicado partes do gulper enguias, que vão desde o tRNAIle gene para CR da organização típica, foram estendendo-se para além de 12 kb (fig. 1)., Antes deste estudo, as regiões putativas duplicadas de rearranjo de vertebrados conhecidos eram 4 kb na melhor das hipóteses. Além disso, todas as sequências de codificação repetidas em tandemly conhecidas estavam restritas a regiões adjacentes às regiões CR, IQM ou WANCY, possivelmente refletindo terminações imprecisas ocasionais de replicações além de suas origens. A região duplicada do mitogenoma de gulper eel era muito maior do que a dos rearranjos vertebrados conhecidos e envolvia quase todo o mitogenoma (Fig. 1).