Fronteiras em Microbiologia

Introdução

Bacillus thuringiensis e outros 7 espécies de esporos formação de bactérias Gram-positivas, incluindo B. cereus, B. cytotoxicus, B. anthracis, B. pseudomycoides, B. weihenstephanensis, B. toyonensis, e B. mycoidesare, são principalmente detectados no solo. Como estas bactérias são altamente similares no genótipo e fenótipo, as bactérias são classificadas como grupo B. cereus na taxonomia (Park et al., 2007). B., cereus e B. thuringiensis são altamente detectáveis nos alimentos, uma vez que são observados em matérias-primas do solo agrícola durante o cultivo e a distribuição. Além disso, estas duas bactérias geralmente não são discriminadas em diagnósticos clínicos. B. cereus é um segundo grupo prioritário de risco de doenças transmitidas por alimentos em produtos agrícolas frescos, e sua contaminação é um dos principais problemas em legumes (Felício et al., 2015). Em especial, B., thuringiensis foi usado como pesticida no cultivo de certas culturas e é bem conhecido como insecticidas microbianos que foram usados para reduzir a quantidade de pesticidas químicos (Azmi et al., 2015).thuringiensis produz proteínas insecticidas, que são o principal tipo de proteínas cristalinas (Cry) (Kutasi et al., 2016). Inversamente, o crescimento ativo de células vegetativas que não têm produção de cristal levam a efeitos não tóxicos. As δ-endotoxinas contêm principalmente Citolíticos (Cít) e Cry (Elleuch et al., 2015; Rao et al., 2015)., No entanto, Cyt e Cry possuem diferentes homologias sequenciais, mesmo que consistam de modos de ação similares para lise celular, que levam a danos permanentes do inseto midgut (Adang et al., 2014).

a variação estrutural de quatro δ-endotoxinas (Cry1, Cry2, Cry3 e Cit2ah) foi observada por cristalografia de raios-X (Dehury et al., 2013). Estes genes são identificados em algodão transgênico e outros vegetais, que são consideravelmente eficazes no controle de pragas., Projetar um biomarcador para o produto traduzido varia com as diferentes categorias de proteína CRI; assim, a detecção será complexa. As sequências do gene 16S rRNA baseadas em primeras universais mostraram alta semelhança (>99%) entre B. cereus e B. thuringiensis (Böhm et al., 2015), que não pode ser classificada através de ensaios genéticos e fenotípicos (Peng et al., 2015). Além disso, tem havido uma discussão desde 2000 sobre se todo o grupo B. cereus deve ser tratado como uma espécie complexa de diversas bactérias (Helgason et al.,, 2000; Bartoszewicz and Marjańska, 2017). Também há sugestões de que a filogenia destas bactérias melhor se adapta às suas propriedades ecológicas (psychrotolerance, virulência) que taxonômicos afiliação (Drewnowska e Swiecicka, 2013; Bartoszewicz e Marjańska, 2017). Para resolver este problema, nós direcionamos XRE para detectar B. thuringiensis, que controla o maior tipo de produção de proteína de cristal.estas duas bactérias são muito semelhantes em resultados bioquímicos (Böhm et al., 2015), e propriedades genéticas (Osman et al., 2015). Cho et al., (2015) also reported that the genetic and phenotypic properties between these bacteria are mal distinguishable. Além disso, Pfrunder et al. reported that B. cereus group species cannot be reliably identified using classical biotyping (Pfrunder et al., 2016). Com base nestes, as experiências bioquímicas podem não ser suficientes para a diferenciação. Em vez disso, a presença de uma proteína cristalina inseticida foi usada como uma característica distinta para diferenciar estas bactérias (Ekino et al., 2014; Wei et al., 2018).,alguns dos factores que diferenciam estas duas bactérias baseiam-se na sua patogenicidade em amostras. B. cereus causa transtorno gastrointestinal, enquanto B. thuringiensis também tem sido envolvido em epidemias de diarréia. Como relatado, a característica distintiva de B. thuringiensis é a presença de proteínas cristalinas insecticidas (δ-endotoxina) criptografadas por genes cry (Osman et al., 2015; Albright et al., 2016). Desde o método de identificação usando o biomarcador para diferenciar B., o grupo cereus é complexo e demorado, um biomarcador altamente eficiente é urgentemente necessário para substituir os anteriores que deram uma menor eficiência e, às vezes, até mesmo mostrou resultados falsos. Com base nos dois genes específicos, o regulador transcritional e os genes da proteína cristalina de B. thuringiensis (Porcar e Juárez-Pérez, 2003; Han et al., 2006), o estudo atual foi realizado para inspecionar e comparar a eficiência do biomarcador projetado (XRE) com a do marcador de proteína cristalina existente (cry2) na identificação de B. thuringiensis de estirpes do grupo B. cereus (Bcg) e não-B., estirpes do grupo cereus (Não B) nos alimentos. Cry2 é a proteína cristalina mais comum presente em B. thuringiensis (Liang et al., 2011; Palma et al., 2014).todas as 120 estirpes, incluindo 111 de Bcg e 9 Não-B, foram obtidas a partir de colecções de bactérias nos Estados Unidos e na Coreia do Sul (quadro suplementar 1). Entre as coleções, B. thuringiensis ATCC 10792 (estirpe do tipo) foi utilizado para a otimização das condições experimentais da PCR convencional e da PCR em tempo real., Todas as estirpes foram descongeladas à temperatura ambiente (25°C) e estriadas no Ágar nutriente (Difco, MI, Estados Unidos). Após a cultura de 24 h a 35 ° C na incubadora, uma colônia pura foi colhida e inoculada em caldo de soja tríptico (Difco, MI, Estados Unidos) e culturas noturnas foram usadas para experimentos subsequentes.

concepção do iniciador e Isolamento do ADN

os respectivos iniciadores direccionam XRE para diferenciar B., thuringiensis (Tabela 1) foram projetados de acordo com a seguinte sequência em Bacillus thuringiensis ATCC 10792 (Gene – 3664610-3665047) usando software Primer Express® (Versão 3.0.1) a partir de Biosystems aplicados localizados em CA, Estados Unidos e sintetizados pela Bioneer Corporation de Daejeon, Coreia. O desempenho do XRE projetado foi comparado com cry2 (Ben-Dov et al., 1997). Após o enriquecimento de 24 h em TSB, uma alíquota de 1 mL de bactérias foi submetida à extracção do ADN genómico utilizando reagente de preparação de amostras Ultra PrepMan® (Applied Biosystems, CA, Estados Unidos)., As concentrações de ADN foram medidas pelo Biospectrómetro® de Eppendorf (Eppendorf, Hamburgo, Alemanha) e ajustadas a 10 ng/µL. As amostras de ADN foram conservadas a -20°C antes da utilização.

PCR convencional e ensaio PCR em tempo Real

a PCR convencional foi preparada com um ciclador térmico C1000 TouchTM a partir de Bio-Rad localizado em Hemel Hempstead, Reino Unido., O tubo de reacção de PCR utilizado Accu-Power® Pyro Quente Iniciar Taq PCR Pré-Mistura de Bioneer Corporation localizado em Daejeon, Coreia e um volume de 20 µL, incluindo 1 µL de cada primer (10 pmoL/µL) e 2 µL de DNA. Amplificação condições da PCR convencional para o regulador transcricional (XRE) foram: inicial de desnaturação a 95°C por 5 min, seguido de 35 ciclos de desnaturação a 95°C por 30 s, recozimento de 49°C por 30 s e alongamento a 72°C por 30 s, e um alongamento final a 72°C por 5 min., As condições de amplificação para a proteína cristalina (Cry 2) foram: desnaturação inicial a 95°C durante 5 minutos, seguida de 35 ciclos de desnaturação a 95°C durante 30 segundos, recozimento a 55°C durante 30 segundos e alongamento a 72°C durante 1 minuto, e um alongamento final a 72°C durante 5 minutos. Após amplificações de DNA, 1,5% (M/V) de solução de gel de agarose contendo solução de ácido nucleico RedsafeTM 20.000 × (Intron Biotechnology, Inc.) foi preparada e a electroforese em gel foi realizada utilizando o modelo de células subcelulares 192 da Bio-Rad localizada em Hemel Hempstead, Reino Unido., As bandas foram visualizadas usando o Smart View Pro UVCI – 1100 Imager system da Major Science localizada em CA, Estados Unidos. A precisão (AC) foi utilizada para avaliar o método PCR utilizando primers XRE e cry2 na detecção de B. thuringiensis da Bcg e do Acordo não-B. negativo (NA) significa o mesmo resultado negativo para a não-B. thuringiensis utilizando PCR com XRE e cry2. Por acordo positivo (PA) entende-se o mesmo resultado positivo para B. thuringiensis utilizando PCR com XRE e cry2. A precisão (AC) é medida utilizando a seguinte equação: AC = ×100% (Ma et al., 2014).,os experimentos PCR em tempo Real foram realizados pelo sistema StepOneTM em tempo real PCR a partir de Biossistemas aplicados localizados em CA, Estados Unidos. Um volume de reacção de 20 µL constituído por 10 µL de mistura principal de fusão de alta resolução de DoctorTM em fusão (HRM), 2 µL de ADN, 0,5 µL da primário F/R (10 pmoL/µL) (Quadro 2). As condições de amplificação do qPCR foram: desnaturação inicial a 95 ° C durante 10 minutos e 40 ciclos a 95°C durante 15 s e 60°C durante 1 minuto. Em seguida, na análise subsequente da curva de fusão, a temperatura foi ajustada para aumentar de 60 para 95°C a 0,3°C/ciclo para testar a especificidade do iniciador.,

Avaliação de PCR em Tempo Real, Composição

O desempenho da XRE e cry2 foi avaliada utilizando 50 cepas de B. thuringiensis, enquanto que a exclusividade foi testada usando-70 não-alvo, bactérias, incluindo 58 B. cereus (Bc), 3 Bcg e 9 não-B (Chelliah et al., 2017). Uma curva padrão foi feita usando 10 vezes diluições do DNA extraído de B. thuringiensis ATCC 10792., As concentrações de ADN foram ajustadas de 10 ng / µL para 100 fg/µL, correspondendo a 2.6 × 106 a 2.6 × 10 UFC, e as amplificações foram realizadas por PCR em tempo real com triplicados. Para controlos negativos, foi utilizada água destilada. Resultados negativos ou não foram consideradas curvas de amplificação quando os valores limiar do ciclo (Ct) foram mais de 40.

A Detecção de B. thuringiensis em amostras de alimentos enriquecidos

alfaces (Lactucasativa), Kimbab e espinafres (Spinaciaoleracea) foram comprados num mercado local em Chuncheon, Coreia., As amostras foram testadas para detectar a ausência de bactérias-alvo de acordo com a norma ISO 7932 (2004). Uma alíquota de 50 g de cada tipo de alimento foi preparada em um saco estomacher estéril de Nasco Whirl-Pak localizado em WI, Estados Unidos. Durante a noite B. as culturas de thuringiensis foram diluídas em 0,5% de água de peptona e utilizadas para preparar as amostras artificialmente contaminadas com níveis de inoculação de 103 A 105 ufc/g (Chon et al., 2012; Kim et al., 2013). Uma alíquota de 1 mL da suspensão de amostras de alimentos foi transferida para um novo tubo esterilizado e utilizada para extração de ADN.,resultados e discussão detecção de B. thuringiensis utilizando o Gene cry2

para as 120 estirpes, foram obtidos produtos de amplificação de aproximadamente 700 bp utilizando os primers cry2 (Tabela 1). Como indicado no quadro 2 e na Figura 1, ao utilizar a PCR direccionada para o cry2, 6 b. estirpes cereus e 36 B. estirpes thuringiensis (72%) foram amplificadas. Nenhum outro grupo B. cereus ou grupo não-B foi amplificado. Isto mostrou uma precisão de 82% do cry2 para detectar grupos B. cereus. Para as 120 estirpes testadas, 100 estirpes deram NAs Ou PAs, indicando uma percentagem global de precisão de 83.,3% (Quadro Suplementar 1). Enquanto Riojas et al. (2015) reported a multiplex PCR of non-ribosomal peptide synthase (NRPS) gene and cry1 to identify B. cereus and B. thuringiensis with a specificity of 24.5% in B. cereus and 15% in B. thuringiensis.