Frontiers / testosterona modifica alterações no músculo Detrusor após obstrução parcial da bexiga em ratos juvenis / Pediatria

introdução

válvulas uretrais posteriores (PUV) é a causa congênita mais comum de obstrução da bexiga pediátrica (1). Embora a taxa de mortalidade do PUV tenha melhorado significativamente com a gestão médica moderna, a uropatia obstrutiva continua a ser uma fonte significativa de morbilidade na idade adulta (2). Até 80% das crianças com PUV apresentam sintomas de incontinência e infecções do tracto urinário (3)., Além disso, até 50% das crianças com PUV irão desenvolver insuficiência renal, com uropatia obstrutiva a causa congénita mais comum de transplante renal (4). Os folhetos da válvula obstrutiva são tratados cirurgicamente logo após o nascimento; no entanto, as crianças com PUV irão desenvolver variabilidade na função da bexiga urinária ao longo de suas vidas. Tem sido demonstrado que a deterioração da bexiga ocorre frequentemente após a puberdade, com uma necessidade crescente de cateterização intermitente limpa (5).estudos utilizando vários modelos animais demonstraram que a bexiga é sensível às hormonas., Especificamente, a substituição de testosterona demonstrou aumentar a massa muscular lisa e a razão músculo liso / colagénio em ratos orquiectomizados (6). Foi estudado um modelo de obstrução parcial da saída da bexiga em ratinhos machos, que demonstrou produzir hipertrofia muscular do detrusor da bexiga (7). A testosterona demonstrou aumentar a fibrose do detrusor em resposta a lesões isquemia–reperfusão em coelhos castrados (8). Contudo, até à data, o efeito das manipulações hormonais na resposta da bexiga masculina do rato às lesões produzidas por obstrução ainda não foi estudado., Portanto, temos a hipótese de que a testosterona participa nas alterações fibróticas maladaptivas que ocorrem após obstrução da saída da bexiga.todos os procedimentos cirúrgicos foram aprovados pelo Comité de cuidados e utilização de animais do Instituto de investigação Infantil de Stanley Manne. Ratos machos CD1 de oito a dez semanas (Charles River Labs, Chicago, IL, EUA) foram alojados em gaiolas separadas para evitar mudanças nos níveis de testosterona causadas pela habitação do grupo. Os ratos foram anestesiados com 3% de Isoflurano e supino posicionado., A parte inferior do abdómen foi rapada e preparada com solução de providone-iodo. Após assegurar uma indução satisfatória da anestesia, foi feita uma incisão cutânea abdominal inferior mediana, que foi realizada através da parede abdominal. A obstrução da saída da bexiga foi realizada de forma semelhante a um relatório anterior, mas com algumas diferenças (obstrução parcial ou grupo de PO) (7). Por favor, note que a obstrução parcial é tipicamente referida como “pBOO”, no entanto, nos referiremos à cirurgia e grupo experimental como PO., Com tracção para cima na bexiga, a dissecação brusca em torno do pescoço da bexiga (proximal à próstata em ratos machos) foi realizada enquanto ocasionalmente retraía a bexiga caudalmente para garantir a dissecação anterior aos uretros. Uma sutura de polipropileno 7-0 foi então passada à volta do pescoço da bexiga e amarrada sobre uma agulha de calibre 23 colocada ao lado da uretra. A agulha foi então retirada., Se os animais machos fossem castrados (obstrução parcial do castrato ou op), simultaneamente os testículos eram retirados da incisão abdominal, as cordas espermáticas ligadas com suturas de polipropileno 6-0 e fortemente divididas. A parede abdominal e a pele foram então fechadas separadamente com suturas 5-0 de poliglactina de forma interrompida. Os animais fictícios foram submetidos a um procedimento idêntico até o ponto de mobilização da bexiga. Os animais foram autorizados a recuperar, desde que o carprofeno fosse dissolvido em água potável e sacrificado às 1 ou 4 semanas após estudos funcionais descritos abaixo., Após o sacrifício pela luxação cervical da coluna sob anestesia isoflurano, os animais foram pesados e as bexigas foram dissecadas ao nível da ligadura. Cada bexiga foi esvaziada de urina e, em seguida, pesada separadamente para 12 Sham, 17 PO, 11 CPO e 11 ratos CPOT.

A administração de testosterona

o cipionato de testosterona foi administrado ao grupo castrado, parcialmente obstruído no momento da castração e semanalmente no pós-operatório na dose de 10 mg / kg (testosterona parcial de castrato ou grupo CPOT)., Para os ratinhos aos quais foi administrada a substituição da testosterona, o sangue foi extraído no momento do sacrifício e enviado para o teste comercial da testosterona para garantir que estavam a receber uma substituição adequada (Antech Diagnostics, Irvine, CA, EUA).

mancha de Voiding no papel (VSOP)

VSOP foi realizada as manhãs dos dias 1, 7 e 28 pós-operatórios para cada rato. Os ratos foram mantidos em gaiolas metabólicas com papel de filtro Whatman subjacente durante 2 h E tiveram acesso ilimitado a alimentos e água. As folhas de papel de filtro foram fotografadas., Foi observado o número e o padrão de vazios e a área de cada mancha foi medida usando ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA). Usando uma curva padrão criada a partir de manchas de vazamento de volumes conhecidos de urina, a área de mancha foi convertida em volume anulado. O volume anulado foi analisado.

A análise histológica

bexigas foi fixada em 10% (M/v) de formalina (Sigma) durante 24 h, embebida em parafina e cortada transversalmente com o colo da bexiga orientado para baixo para produzir secções de 4 µm. Seções de 4 ratos sham, 4 PO, 4 CPO e 4 CPOT foram manchadas com trícromo de Masson., As seções foram fotografadas a 10× e 40× ampliação usando um microscópio reto Leica conectado a uma câmera e as imagens foram gravadas digitalmente usando OpenLab para Mac. A razão Col / SM foi quantificada utilizando o Photoshop Adobe, como descrito anteriormente, e calculada em média a partir de quatro secções 40× por bexiga. Para a imunoformação, as bexigas foram fixadas em 4% (M/v) de formaldeído feito a partir de paraformaldeído (EM Sciences) durante a noite. O tecido foi lavado em DPBS e equilibrado sequencialmente em 20% (m/v) e 30% (M/v) de sacarose (Sigma) em DPBS., Os tecidos foram congelados em moldes descascados contendo OCT (tecidual Tech) num banho de isopentano de gelo seco (Sigma).

anticorpos Imunofluorescentes

bexigas fixas de 3 sham, 3 PO, 3 CPO e 3 ratos CPOT foram utilizados. Secções de 10 µm foram cortadas para todas as experiências. As secções foram lavadas duas vezes em PBS, incubadas durante 5 minutos à temperatura ambiente em PBS + 0, 1% Tween (PBT) e bloqueadas durante 30 minutos à temperatura ambiente com 10% de soro de burro em PBT., A miosina do músculo liso (SMM) foi detectada da mesma forma utilizando a miosina do músculo anti-liso do coelho (tecnologias biomédicas, 1:100) em conjunto com o anticorpo secundário anti-coelho Alexa Fluor 546 (tecnologias de vida, 1:400).

os grupos de análise estatística

foram comparados usando ANOVA com análise pós–hoc do Estudante–Newman-Keuls. Os resultados com p < 0,05 foram considerados significativos. SPSS v22. 0 foi utilizado para análise estatística. As barras de erro nas figuras reflectem SEM.,

Resultados

PO Leva a Alterações Funcionais Determinado por Estudos Urodinâmicos e a Anulação da Mancha no Papel

Parcial obstrução da saída da bexiga foi realizada no masculino CD-1 ratos e comparou dois grupos: ratos machos submetidos à cirurgia sham e de ratos machos submetidos parcial obstrução da saída da bexiga com a castração. Medimos os níveis séricos de testosterona em ratinhos castrados e descobrimos que os níveis desceram para (<20 pg/dL) em 24 horas após a orquiectomia., Os efeitos da obstrução na função da bexiga foram determinados utilizando estudos urodinâmicos nestes três grupos. A figura 1A demonstra pressões de voiding máximas elevadas 1 semana após obstrução no ratinho op e OP, em comparação com os ratinhos de cirurgia fictícia. Os rastreamentos urodinâmicos representativos também demonstram instabilidade a 1 semana em ratos de OP e OP (figura 1C). A VSOP realizada 1 semana após obstrução reflecte o efeito de obstrução em ratinhos com OP e OP que não é observado em ratinhos para cirurgia de simulação de embuste (figuras 1B,D)., Assim, o nosso modelo de pó teve efeitos funcionais significativos na micção tanto em ratos PO como em ratos op 1 semana após a cirurgia.

FIGURA 1

a Figura 1. Cistometria (a) e volume máximo médio de vazios (B) de ratinhos 1 semana após terem sido submetidos a PO. As colunas são (da esquerda para a direita) Sham, PO, CPO. C) marcadores representativos da análise de cistometria. D) imagens representativas de manchas de deslizamento em papel Whatman colocado sob ratos durante 2 h, tal como visualizadas com imagens ultravioletas. As barras de erro são SEM., A significância estatística (P < 0, 05) é indicada acima das barras com um asterisco.

O VSOP, realizado 4 semanas após a obstrução, demonstra que os ratinhos PO têm padrões obstrutivos persistentes de voiding com volumes máximos de VOID mais pequenos do que os ratinhos op. Ao mesmo tempo, os ratos do CPO recuperam volumes máximos anulados semelhantes aos ratos para cirurgia de simulação da administração (figuras 3A–C)., O padrão global no VSOP dos ratinhos op voltou ao normal enquanto os ratinhos PO continuam a demonstrar a pulverização Indiscreta da urina indicando perda de controlo da bexiga.a remodelação da bexiga após PO é alterada pela castração

descobrimos que os efeitos na função da bexiga estavam correlacionados com alterações macroscópicas na bexiga do rato em ratinhos PO e OP. No momento do sacrifício do rato às 4 semanas após PO, as bexigas de sham pareciam normais em tamanho, mas PO e CPO bexiga foram grosseiramente ampliadas (figuras 2A,C–E)., Após dissecação da distal da bexiga à ligadura do pescoço da bexiga, bexigas foram expressas de urina e pesadas. Aqui, encontramos um aumento do peso da bexiga nos ratos PO, comparado com a cirurgia de simulação da fraude e os ratos do CPO. Os ratinhos com OP não demonstraram aumento de peso em comparação com os ratinhos para cirurgia de simulação da cirurgia (figura 2B). A avaliação histológica das bexigas destes ratos foi realizada com H&e foram comparadas a área de coloração e bexiga, circunferência e espessura., Tanto os ratos de OP como de OP demonstraram um aumento da área e da circunferência em comparação com os ratos de cirurgia de simulação da simulação da embolia, reflectindo alterações das pressões da bexiga elevadas após PO (figuras 2F,H). No entanto, o aumento da espessura da bexiga só foi observado em ratinhos PO (figura 2G). Isto correlacionou-se com os pesos mais baixos da bexiga em ratinhos de OP, sugerindo que o aumento do tamanho da bexiga é principalmente devido ao “alongamento” do músculo da bexiga, em oposição à hipertrofia ou hiperplasia do músculo da bexiga.

FIGURA 2

FIGURA 3

a Figura 3., Cistometria (a) e volume médio máximo anulado (B) 4 semanas após o Sham ou PO. C) imagens representativas de manchas de limpeza de camundongos do Sham, PO ou CPO 1 e 4 semanas após a cirurgia. As barras de erro são SEM. A significância estatística está indicada acima das barras com asteriscos (**P < 0, 01). NS indica que a diferença não foi estatisticamente significativa.,

Bexiga de Fibrose, e Aumenta a seguir Parcial Obstrução da Saída da Bexiga

a fim de investigar se o aumento na bexiga massa e a espessura da parede da bexiga foi devido exclusivamente muscular, hipertrofia/hiperplasia ou se um componente de fibrose foi envolvido, histológicas exame de sham, PO, e CPO mouse bexigas foi realizado em 4 semanas após a obstrução. Isto foi feito utilizando tanto a coloração do tricromo de Masson como a imunofluorescência específica ao marcador de fibrose (Figura 4)., Como esperado, em ratos PO, após obstrução, as bexigas foram encontrados para ter maiores razões de Col/SM. Com a castração, o aumento da razão Col/SM já não foi encontrado (figura 4B). Embora o volume da bexiga do luminal tenha aumentado nos ratos da OP, a camada muscular não demonstrou hipertrofia, como evidenciado por ter a mesma espessura da parede da bexiga que os ratos da cirurgia do sham. Além disso, a avaliação dos marcadores específicos da fibrose vimentina, Col1a1 e FSP-1 pela imunofluorescência demonstrou um aumento da expressão em ratinhos com pó comparativamente a ratinhos com sham, com uma diminuição correspondente na expressão em ratinhos com o CPO., Parece que a castração cria condições nas quais a remodelação da bexiga não fibrótica ocorre, argumentando por um papel potencial da testosterona especificamente na mediação de uma resposta fibrótica à lesão da bexiga.

FIGURA 4

Figura 4. Presença de proteínas fibróticas na parede da bexiga após PO. A) um gráfico de barras que mostre a média de fluorescência da área percentual para o Col1a1. A significância é indicada por * * * P < 0, 001 ou ***P < 0, 0001. (B) Gráfico de barras que mostra a razão Col/SM em bexigas de Sham, PO e CPO., A significância é indicada por * p < 0, 05. C) imagens de imunofluorescência representativas da vimentina, Col1a1, FSP-1 e do tricromo de Masson. A coloração do anticorpo é vermelha e a contra-resistência do DAPI é azul. Filas de painéis são seções (de cima a baixo) Sham, PO e CPO. As linhas são indicadas à esquerda. A barra de ampliação no painel superior esquerdo é de 100 µm e representa a ampliação para todos os painéis.,

Introdução de Testosterona Exógena Inverte os Efeitos Benéficos da Castração Parcial seguinte Obstrução da Saída da Bexiga

temos mostrado que a castração na definição de PO vai atenuar o pós-obstrutiva remodelação no que diz respeito a bexiga hipertrofia/hiperplasia e fibrose. Para demonstrar que esta é uma resposta específica à testosterona, após a castração, um grupo de ratinhos passou por suplementação de PO e testosterona. Aqui, nós usamos testosterona ou seu produto reduzido dihidrotestosterona (DHT)., DHT tem 10 vezes a afinidade para o receptor androgênio em comparação com a testosterona e não pode ser aromatizado para estrogênio, reduzindo a probabilidade de que as mudanças que ocorrem a partir da suplementação de testosterona são devido ao aumento dos níveis de estrogênio. Os volumes anulados máximos determinados pelo VSOP foram significativamente mais baixos no CPO mais testosterona (CPOT) ou no CPO mais DHT (CPOD) ratinhos, em comparação com o CPO ratinhos (figura 5A). As alterações macroscópicas e microscópicas observadas em ratos PO (mas não em ratos de OP) reapareceram em bexigas de CPOT e CPOD., O peso da bexiga aumentou significativamente nos ratinhos CPOT e CPOD em comparação com os ratinhos CPO (figura 5B). As bexigas de CPOT e CPOD também aumentaram as razões Col/SM em comparação com o CPO (figura 5D). Os marcadores de fibrose também aumentaram na CPOT e CPOD, em comparação com as bexigas de CPO, como foi a reação à mancha de tricromo de Masson (figuras 5C,E). Estes resultados demonstram que a substituição exógena da testosterona em ratinhos machos castrados restaurou completamente os efeitos patológicos da obstrução à bexiga urinária., Em suma, os efeitos da castração e da substituição da testosterona suportam fortemente um papel para o andrógeno masculino na patogênese da obstrução da bexiga.

Figura 5

discussão

Rapazes nascidos com PUV sofrem ressecção cirúrgica dos folhetos obstrutivos logo após o parto. No entanto, apesar de aliviar a obstrução da saída da bexiga nestas crianças, muitos pacientes com progresso de PUV para a deterioração da bexiga, exigindo cateterização intermitente limpa para esvaziar adequadamente a bexiga (3). Estas alterações foram frequentemente observadas após a puberdade., As alterações clínicas em doentes com válvulas ressecadas foram anteriormente atribuídas a alterações fisiológicas associadas à adolescência, tais como aumento da filtração urinária e não a alterações hormonais (1, 5, 9). No entanto, nossas descobertas sugerem que androgênio pode desempenhar um papel mais importante do que anteriormente apreciado. Descobrimos que a presença ou ausência de andrógenos afeta especificamente as alterações celulares que ocorrem após obstrução, em particular fibrose.,a informação obtida a partir de estudos nos quais a testosterona foi suplementada em doentes com doença do tracto urinário inferior pode dar uma ideia dos efeitos dos androgénios na doença da bexiga. Estes dados são relativamente escassos, provenientes em grande parte de estudos observacionais retrospectivos ou prospectivos e estudos nos quais a testosterona foi administrada a homens hipogonadais ou eugonadais. No entanto, estes estudos sugerem que a suplementação com testosterona não piora os LUTS (10, 11)., Especificamente, vários estudos demonstraram uma melhoria na pontuação da IPSS em homens a receber suplementação androgénica, embora muitos destes não estudassem especificamente homens com obstrução conhecida da bexiga, mas incluíssem uma coorte tratada com suplementação de testosterona e com diferentes graus de LUTS no início. Um estudo excluiu os doentes com obstrução conhecida do pescoço da bexiga. Koritsiadis et al., fez especificamente comparar sintomas e urodinâmica parâmetros de pressão, estudos de fluxo de hypogonadal e eugonadal homens e encontrado soro nível de testosterona para ser negativamente correlacionada com a pressão do detrusor no máximo fluxo, mas não IPSS ou quaisquer outros parâmetros urodinâmicos (12).o efeito da testosterona no músculo detrusor da bexiga também foi estudado em modelos animais. Tek e colegas descobriram que a suplementação de testosterona de ratos castrados cirurgicamente resultou numa diminuição da relação colagénio / músculo liso e no aumento da capacidade cistométrica (13). Shortliffe et al., (14) verificou-se que a substituição da testosterona em ratos castrados cirurgicamente também estava associada ao aumento do músculo liso da bexiga, bem como ao aumento da massa da bexiga (14). Em conjunto, estes estudos indicam que, em ratos não obstruídos, a testosterona estimula o crescimento do músculo liso detrusor através de um mecanismo ainda pouco claro. In an ischemia-reperfusion bladder injury model in male rabbits, Chuang et al. demonstrou que a castração foi protectora pela diminuição da fibrose da bexiga e pela diminuição da expressão de vários marcadores relacionados com fibrose (8)., A suplementação de testosterona destes coelhos castrados levou a um aumento da fibrose detrusor após lesão na bexiga. As nossas descobertas espelham estas descobertas e representam o primeiro estudo do efeito da testosterona na resposta à lesão da bexiga do pó em ratinhos juvenis.ao mesmo tempo, a escassez de achados na literatura nos surpreendeu com nossos achados iniciais. Uma preocupação potencial que tínhamos era que os ratos não eram suficientemente obstruídos e que nossas descobertas em ratos castrados representava um grupo no qual a obstrução simplesmente não ocorreu., No final, sabemos que isso não é verdade porque bexigas no grupo de OP inicialmente tinham manchas de anulação como o grupo obstruído, tinha pressões anormais por cistometria, e tinha bexigas remodeladas. Na verdade, as bexigas de ratos de CPO eram muito diferentes dos shams, indicando que a cirurgia de PO produziu efeitos profundos. Nossa interpretação destes achados é que nas horas seguintes à cirurgia, a pressão aumenta dentro da parede da bexiga e que, em ratinhos normais, colágenos e outras matrizes de endurecimento são construídos para evitar rupturas da bexiga no abdômen., Bexigas de ratos do CPO tiveram muito pouca deposição de colágeno dentro do músculo detrusor, mas ao mesmo tempo, tornou-se muito grande com paredes finas. É possível que quando a resposta fibrótica é prejudicada em uma bexiga de alta pressão, ela se estica para acomodar a urina que se acumula. Isto é típico do que observamos no CPO, mas não PO e bexigas de CPOT. Assim, nós hipotetizamos que o papel da testosterona pode ser especificamente na mediação da fibrose na parede da bexiga.,embora o nosso trabalho tenha utilizado especificamente um modelo da bexiga para determinar o papel da testosterona na fibrose muscular em resposta a lesões musculares suaves, acreditamos que esta investigação será importante em muitos processos de doença fibrótica que têm uma associação sexual. Na verdade, isso tem sido apoiado por alguns estudos na literatura. Cho et al. demonstrou que a orquiectomia atenuou a fibrose renal observada após obstrução ureteral. Num modelo de rato de obstrução ureteral unilateral, os rins de ratinhos machos demonstraram uma expressão aumentada da deposição de alfa-SMA e colagénio (15)., Semelhante ao nosso modelo de obstrução da bexiga, esta resposta fibrótica foi minimizada se a orquiectomia concomitante foi realizada com obstrução ureteral. Foram notificados resultados análogos num modelo de ratinho de fibrose cardíaca secundária à sobrecarga de pressão. Aqui, as alterações fibróticas no ventrículo esquerdo foram atenuadas por orquiectomia. Isto incluiu uma manobra da via de sinalização TGFß, conhecida por ser importante para promover a diferenciação myofibroblast (16). A fibrose Cardíaca e renal relacionada com a idade foi também atenuada por orquiectomia em ratinhos machos (17)., Além disso, num estudo realizado por Zhu e colegas, o receptor androgénico nas células musculares lisas vasculares foi implicado na calcificação muscular lisa estimulada pela testosterona. Utilizando células musculares lisas vasculares derivadas de um ratinho knockout do receptor androgénico específico do músculo liso, a calcificação foi atenuada em resposta ao tratamento com testosterona em comparação com células musculares lisas tipo selvagem (18). Assim, um número crescente de estudos, incluindo o nosso, estão encontrando uma associação entre a testosterona e as alterações patológicas associadas à fibrose.,o mecanismo subjacente ao papel da testosterona na modulação da resposta detrusor à lesão permanece inexplicável. Mais trabalho investigando os efeitos a jusante da testosterona no músculo detrusor poderia revelar novos alvos terapêuticos que poderiam ser utilizados para prevenir ou, pelo menos, melhorar a remodelação adversa do tecido vista no ajuste do pó. Adicionalmente, podem ser realizados estudos de resposta à dose para determinar em que concentrações séricas de testosterona conduzem a remodelação adversa. O estrogénio demonstrou atenuar a hipoxia tecidular e as lesões associadas ao detrusor em modelos animais., Um estudo mais aprofundado da interacção entre a testosterona e o estrogénio na modulação da resposta do músculo detrusor à lesão pode também ajudar a elucidar ainda mais esta via.

conclusão

ratos machos jovens com obstrução parcial da bexiga têm bexigas de alta pressão mais pequenas que são fibróticas. A castração foi associada a maiores volumes anulados, menor peso da bexiga e menos fibrose detrusor. A substituição da testosterona em ratinhos castrados reverteu estes efeitos., Isto indica que a testosterona desempenha um papel na modificação das alterações do músculo detrusor após obstrução parcial da bexiga em ratinhos. Assim, sugerimos que o aumento dos níveis de testosterona em meninos com PUV pode contribuir para a diminuição da função da bexiga.este estudo foi realizado de acordo com as recomendações das orientações cirúrgicas, do Comité de cuidados e Utilização dos animais. O protocolo foi aprovado pelo Comité de cuidados e Utilização dos animais.

Autor Contributions

AF, PF, DB, NK, and GS data collection and analysis., AF, PF, RD, and EG conception, design, and manuscript writing.

Declaração de conflito de interesses

os autores declaram que a investigação foi realizada na ausência de quaisquer relações comerciais ou financeiras que possam ser interpretadas como um potencial conflito de interesses.

financiamento

esta investigação foi apoiada por financiamento da Associação Hartwell para EG.

4. Holmdahl G, Sillen U. Boys with posterior uretral valves: outcome concerning renal function, bladder function and paternity at ages 31 to 44 years., J Urol (2005) 174(3):1031–4; discussion 1034. doi:10.1097/01.ju.0000170233.87210.4f