Médio de ácidos graxos de cadeia diminuir o colesterol, através da redução dos intestinal de ácidos biliares reabsorção em C57BL/6J ratos

os Animais e dietas

Macho C57BL/6 J ratos (4 semanas de idade, n = 80) foram adquiridos pelo Instituto de Animais de Laboratório de Ciências, da Academia Chinesa de Ciências Médicas (Licença Nº. SCXK: JING2009-0007) e alojado numa sala com temperatura controlada (22 °C ± 2 ° C, 40% a 60% de humidade) com um ciclo de 12 horas de luz/escuridão., O Comité de cuidados e Utilização dos animais do Hospital Geral PLA Chinês aprovou todos os procedimentos experimentais.ratinhos foram alimentados com uma dieta basal (dieta AIN-93G, comprada da Academia de ciências médicas militares) durante a primeira semana para adaptação. Dez ratos foram escolhidos aleatoriamente e alimentados com uma dieta basal como o controle normal, e os restantes ratos foram alimentados com uma dieta rica em colesterol (CR) modificada a partir da dieta AIN-96G. Amostras de sangue foram recolhidas do plexo venoso mandibular duas semanas depois., Os ratos com níveis séricos de TC que foram 2 desvios-padrão superiores ao controlo normal (representando 67% dos ratinhos alimentados com a dieta CR) foram distribuídos aleatoriamente a três grupos (n = 12 em cada grupo). Cada grupo recebeu uma dieta diferente durante 16 semanas (Tabela 1): triglicéridos de cadeia média e rica em colesterol (CR-MCT), triglicéridos de cadeia longa e ricos em colesterol (CR-LCT) ou CR. Nisshin Oyllio (Tóquio, Japão) doou os MCTs (C8:0 e C10:0) e LCTs (triglicéridos de cadeia longa, óleo de soja). O colesterol foi comprado a Sigma-Aldrich (St.Louis, MO, EUA)., O Instituto de recursos nutricionais de Pequim (Pequim, China) mediu as composições de ácidos graxos das dietas CR-MCT e CR-LCT (Tabela 2). O peso corporal e a ingestão de alimentos foram monitorizados semanalmente.,

de Sangue, íleo, bile e fezes de amostragem

Cinco ratos foram escolhidos aleatoriamente a partir de cada grupo após 16 semanas de alimentação para gravar dieta a ingestão e a excreção de fezes utilizando diferentes gaiolas metabólicas por 3 dias., As fezes foram liofilizadas, pesadas, pulverizadas e conservadas a − 80 °C para análise posterior. Todos os ratinhos foram jejuados durante a noite (aproximadamente 12 h) antes da colheita de amostras de sangue da aorta ventral sob anestesia (cloridrato de xilazina). O soro foi colhido após centrifugação das amostras de sangue. Um microcapsule foi usado para perfurar a parede da vesícula biliar e extrair a bílis, e cada amostra biliar foi centrifugada a 16.000 g durante 30 minutos. O sobrenadante foi recolhido e armazenado a-80 ° C., Os tecidos do íleo foram excisados e enxaguados com solução salina gelada, e as porções foram imediatamente armazenadas a-80 °C para posterior análise.a medição dos perfis lipídicos séricos

C e triglicéridos séricos (TG) foi determinada no final da experiência utilizando kits comerciais de Wako (Osaka, Japão). O colesterol-lipoproteína de alta densidade (HDL-C) e o colesterol-lipoproteína de baixa densidade (LDL-C) foram medidos utilizando métodos sedimentares e um kit comercial de Abcam (Cambridge, Reino Unido). O ácido biliar total sérico (TBA) foi medido usando um kit comercial do gene azul (Xangai, China)., Todas as instruções do fabricante foram rigorosamente seguidas.os métodos para a preparação e determinação dos ácidos biliares nas fezes e bílis foram realizados de acordo com o nosso estudo anterior e relatórios de Steiner et al. . Foi utilizado um sistema de cromatografia líquida de alta resolução Shimadzu LC-20 AD (Shimadzu, Kyoto, Japão) associado a um espectrómetro de massa de armadilha de 3200 Q aplicado com uma fonte de ionização por electrospray (esi) (Applied Biosystems, Carlsbad, EUA). Os sistemas HPLC e MS foram controlados usando o analista 1.4.,2 software. All chromatographic separations were performed using a Venusil AQ C18 column (2.5 μm, 50 mm × 2.1 mm) (Agela Techonologies, Delaware, USA). Cholic acid (CA), deoxycholic acid (DCA), chenodeoxycholic acid (CDCA), ursodeoxycholic acid (UDCA), lithocholic acid (LCA), taurocholic acid (TCA), taurodeoxycholic acid (TDCA), taurochenodeoxycholic acid (TCDCA), taurolithocholic acid (TLCA), glycocholic acid (GCA), glycodeoxycholic acid (GDCA) and glycochenodeoxycholic acid (GCDCA) were used as standard substances. Chloramphenicol was used as an internal standard., Os materiais acima referidos foram adquiridos à Sigma-Aldrich (St.Louis, MO, EUA). Os ácidos biliares primários, incluindo CA, CDCA, TCA, TCDCA, GCA e GCDCA, e os ácidos biliares secundários, incluindo DCA, LCA, UDCA, TLCA, TDCA e GDCA, na bílis e fezes foram determinados pelos tempos de retenção.

PCR quantitativa em tempo real (qRT-PCR)

amostras de tecido do intestino delgado (aproximadamente 100 mg) foram lavadas com PBS gelado e homogeneizadas. O RNA Total de tecidos e células foi isolado utilizando reagente de Trizol (Omega Bio-Tek, Norcross, EUA, no. R6812). Os iniciadores foram projetados usando o Primer Express 3.,0 software baseado nas sequências de mRNA de uma base de Dados (Tabela 3) e sintetizado por Invitrogen (Pequim, China). Métodos de extração de RNA e PCR quantitativa em tempo real (qRT-PCR) são descritos em nossas publicações anteriores. o qRT-PCR foi realizado utilizando um kit RT-PCR SYBR® PrimeScript® one Step (Takara Biotechnology Co., Ltd., Dalian, China). A amplificação foi realizada usando um BIO-RAD iCycler térmico Cycler (BIO-RAD, Hercules, CA, EUA). Os níveis de expressão do ARNm relativos foram determinados utilizando o método comparativo do limiar crítico (TC) (num tubo separado)., O gene de limpeza β-actina foi usado como um controle para a normalização.

Western blot composição

Western blot análises de tecido do intestino delgado e células cultivadas foram realizados como descrito anteriormente . Quantidades equivalentes de proteínas de cada amostra foram preparadas e separadas utilizando a SDS-PAGE (12% de gel) seguida de electrotransferências para membranas PVDF., As membranas foram incubadas com uma solução de bloqueio (solução salina tamponada com Tris, 8% de leite seco sem gordura) durante 2 h, seguida de incubação com anticorpos específicos a 4 °C durante a noite. As membranas foram lavadas exaustivamente em TBST (Tris-buffered saline com Tween, contendo 0,5% de Tween-20 em TBS) e incubadas com peroxidase de rábano secundário conjugado de anticorpos em TBST por 1 h. As membranas foram lavadas mais em TBST, e bandas foram detectadas através de quimioluminescência detecção de agentes. Blot densitometry was performed, and the bands were analysed using ImageJ software., Os anticorpos que visavam o transportador apical de ácido biliar dependente de sódio (ASBT), a proteína de ligação do ácido biliar ileal (I-BABP) e o transportador orgânico de soluto α/β (Osta/β) foram comprados à Abcam (Cambridge, Reino Unido). Foram obtidos anticorpos secundários contra a IgG de cabra da Sun Biomedical Technology Co. (Pequim, China).

imunofluorescência

íleo tecido fixado com 4% de paraformaldeído tamponado foi incorporado na parafina, e foram preparadas secções de 4 µm de espessura. As secções foram desparafinizadas e encerradas em 3% H2O2 durante 15 minutos para bloquear a peroxidase endógena., As secções foram lavadas em PBS e incubadas com um anti-eu-BABP de anticorpos em PBS (diluição 1:50) por 1 h a 37 °C. UM FITC conjugado (isotiocianato de fluoresceína) anticorpo foi adicionado em uma diluição 1:50 e incuba-se por 0,5 h a 37 °C. as Secções foram lavadas, e PI (iodeto de propidium) foi utilizado para manchar os núcleos. I-BABP foi fotografado usando um microscópio de fluorescência (BX60, Olympus, Ina, Japão). I-BABP foi observado como fluorescência verde, e o núcleo foi observado como fluorescência vermelha .,

Caco-2 cell culture

The Caco-2 cell line was obtained from the Cell Resource Center, Peking Union Medical College (which is the headquarters of the National Infrastructure of Cell Line Resource) on Sept. 20, 2016. A PCR e a cultura confirmaram que a linha celular foi verificada sem contaminação por micoplasma. A origem das espécies destas células foi confirmada através da PCR. A identidade da linha da célula foi autenticada usando o perfil STR (FBI, CODIS) . Todos os resultados estão disponíveis no site (http://cellresource.cn)., As células Caco-2 foram cultivadas no meio da Águia modificada de Dulbecco (DMEM) contendo 10% de soro fetal bovino (FBS), 1% de penicilina-estreptomicina e 1% de aminoácidos não essenciais. As células Caco-2 foram mantidas a 37 ° C numa atmosfera humidificada contendo 5% de CO2 e 95% de ar. O meio foi alterado a cada 2 dias. O DMEM, FBS, 1% aminoácidos não essenciais, e outros materiais foram comprados a partir da infra-estrutura nacional de recurso de linha celular (Pequim, China) ou Sigma-Aldrich (St.Louis, MO, EUA).,

ensaio de permeabilidade do ácido caprílico através de monocamadas de células Caco-2

para experiências de reabsorção de ácido biliar, referindo-se ao relatório de Y. Wang, et al. , as células foram semeadas e cultivadas em inserções de cultura de células Penduradas de Millicell (0,4 µm, Millipore, Molsheim, França) por 21 dias para obter células confluentes e altamente diferenciadas. A formação de monocamadas epiteliais funcionais foi monitorada através da medição da Resistência Elétrica transepitelial (TEER) usando um medidor Millicelial (Millipore) antes dos experimentos., A morfologia celular foi observada usando um microscópio eletrônico, e a permeabilidade foi determinada usando Lucifer Yellow (Sigma, MO, EUA) como marcador.

a preparação de ácidos gordos e CA foi realizada como descrito por X. Zhang, et al. . Ácidos graxos e CA foram medidos e dissolvido em etanol, em seguida, foram diluídos com meio de cultura celular, contendo 20 mg/L de endotoxinas livre de BSA para uma concentração final de 50, 100 ou 200 µmol/L (etanol< 0.1%). Os ácidos gordos dissolvidos e CA foram incubados num banho de água a 37 °C durante 1 h antes da adição às células., O ácido caprílico (C8:0), o ácido cáprico (C10:0), o ácido esteárico (C18:0) e o ácido oleico (C18:1) foram comprados a Sigma-Aldrich (St.Louis, MO, EUA).os lados apical (AP) e basolateral (BL) da monocamada foram lavados com a solução salina equilibrada (HBSS) de Hank e equilibrados no meio completo sem soro durante 15 minutos. O meio da AP foi substituído por meio fresco contendo CA (200 µmol / L) ou misturado com um dos ácidos gordos (C8: 0, C10: 0, C18: 0 ou C18: 1) a 50, 100 ou 200 µmol / L., A viabilidade celular das células Caco-2 em diferentes condições foi avaliada pelo ensaio de citotoxicidade celular WST-1 (Fig. 1). O meio com um dos ácidos gordos foi definido como o”grupo C8:0, C10:0, C18:0 ou C18:1″. O ” grupo de controle “não continha ácidos graxos, e o” grupo em branco ” não tinha CA e ácidos graxos. Apenas foi utilizado meio fresco no BL. Os meios de comunicação dos lados AP e BL foram removidos 2 h depois e armazenados para análises de AC usando HPLC-MS., A permeabilidade aparente (Papp) foi calculada usando a seguinte equação: Papp = dQ/dt× 1/C0A (dQ é o composto aparição no compartimento receptor, dt é o tempo, C0 é a concentração no compartimento doador, e A é a área da superfície da pastilha).