acizi grași cu lanț Mediu scăderea colesterolului prin reducerea intestinale a acizilor biliari, reabsorbția în C57BL/6J șoareci

Animale și diete

de sex Masculin C57BL/6 J șoareci (4 săptămâni n = 80) au fost achiziționate de la Institutul de Animale de Laborator de Științe, Academia Chineză de Științe Medicale (Licență Nr. SCXK: JING2009-0007) și adăpostite într-o cameră cu temperatură controlată (22 ± 2 °C, 40% până la 60% umiditate) cu un ciclu de lumină/întuneric de 12 ore., Comitetul de îngrijire și utilizare a animalelor al Spitalului General PLA din China a aprobat toate procedurile experimentale.șoarecii au fost hrăniți cu o dietă bazală (dieta AIN-93G, achiziționată de la Academia de științe Medicale Militare) în prima săptămână pentru adaptare. Zece șoareci au fost aleși la întâmplare și au hrănit o dietă bazală ca control normal, iar șoarecii rămași au fost hrăniți cu o dietă bogată în colesterol (CR) modificată din dieta AIN-96G. Probele de sânge au fost colectate din plexul venos mandibular două săptămâni mai târziu., Șoarecii cu niveluri serice de TC care au fost 2 abateri standard mai mari decât controlul normal (reprezentând 67% dintre șoarecii hrăniți cu dieta CR) au fost repartizați aleatoriu în trei grupuri (n = 12 în fiecare grup). Fiecare grup a fost hrănit cu o dietă diferită timp de 16 săptămâni (Tabelul 1): trigliceride bogate în colesterol și cu lanț mediu (CR-MCT), trigliceride bogate în colesterol și cu lanț lung (CR-LCT) sau CR. Nisshin Oillio (Tokyo, Japonia) a donat MCTs (C8:0 și C10:0) și LCTs (long-trigliceride cu lanț, ulei de soia). Colesterolul a fost achiziționat de la Sigma-Aldrich (St.Louis, MO, SUA)., Institutul de resurse nutriționale din Beijing (Beijing, China) a măsurat compozițiile de acizi grași din dietele CR-MCT și CR-LCT (Tabelul 2). Greutățile corporale și aportul alimentar au fost monitorizate săptămânal.,

Sânge, ileon, bilă și fecale de eșantionare

Cinci șoareci au fost alese la întâmplare din fiecare grup după 16 săptămâni de hrănire pentru a înregistra dieta de admisie și fecale, excreția prin folosirea unor cuști metabolice timp de 3 zile., Materiile fecale au fost liofilizate, cântărite, pulverizate și depozitate la − 80 °C pentru analize suplimentare. Toți șoarecii au fost postiți peste noapte (aproximativ 12 ore) înainte de recoltarea probelor de sânge din aorta ventralis sub anestezie (clorhidrat de xilazină). Serul a fost colectat după centrifugarea probelor de sânge. O microcapsulă a fost utilizată pentru a perfora peretele vezicii biliare și a extrage bila, iar fiecare probă de bilă a fost centrifugată la 16,000 g timp de 30 min. Supernatantul a fost colectat și depozitat la − 80 °C., Țesuturile ileonului au fost excizate și clătite cu soluție salină rece cu gheață, iar porțiunile au fost depozitate imediat la-80 °C pentru analize suplimentare.

măsurarea profilurilor lipidelor serice

TC și trigliceride serice (TG) au fost determinate la sfârșitul experimentului folosind kituri Comerciale de la Wako (Osaka, Japonia). Lipoproteine-colesterol cu densitate mare (HDL-C) și lipoproteine-colesterol cu densitate mică (LDL-C) au fost măsurate folosind metode de sedimente și un kit comercial de la Abcam (Cambridge, Marea Britanie). Serul de acid biliar total (TBA) a fost măsurat utilizând un kit comercial de la Blue Gene (Shanghai, China)., Toate instrucțiunile producătorului au fost respectate cu strictețe.

analiza acizilor biliari în fecale și bilă folosind HPLC-MS

metodele de preparare și determinare a acizilor biliari în fecale și bilă au fost efectuate conform studiului nostru anterior și rapoartelor Steiner et al. . A fost utilizat un sistem de cromatografie lichidă de înaltă performanță Shimadzu LC-20 AD (Shimadzu, Kyoto, Japonia) cuplat la un spectrometru de masă Trap Applied Biosystecm 3200 Q cu o sursă de ionizare electrospray (ESI) (Applied Biosystems, Carlsbad, SUA). Sistemele HPLC și MS au fost controlate folosind Analyst 1.4.,2 software. All chromatographic separations were performed using a Venusil AQ C18 column (2.5 μm, 50 mm × 2.1 mm) (Agela Techonologies, Delaware, USA). Cholic acid (CA), deoxycholic acid (DCA), chenodeoxycholic acid (CDCA), ursodeoxycholic acid (UDCA), lithocholic acid (LCA), taurocholic acid (TCA), taurodeoxycholic acid (TDCA), taurochenodeoxycholic acid (TCDCA), taurolithocholic acid (TLCA), glycocholic acid (GCA), glycodeoxycholic acid (GDCA) and glycochenodeoxycholic acid (GCDCA) were used as standard substances. Chloramphenicol was used as an internal standard., Materialele menționate mai sus au fost achiziționate de la Sigma-Aldrich (St.Louis, MO, SUA). Primară a acizilor biliari, inclusiv CA, CDCA, TCA, TCDCA, GCA și GCDCA, și secundară a acizilor biliari, inclusiv DCA, LCA, UDCA, TLCA, ACDC și GDCA, în bilă și fecale au fost determinate de timpul de retenție.

cantitative real-time PCR (qRT-PCR)

probele din țesutul intestinului subțire (aproximativ 100 mg) au fost spălate cu PBS rece ca gheața și omogenizate. ARN-ul Total din țesuturi și celule a fost izolat folosind reactiv Trizol (Omega Bio-Tek, Norcross, SUA, no. R6812). Grundurile au fost proiectate folosind Primer Express 3.,0 software-ul bazat pe secvențele ARNm dintr-o bază de date (Tabelul 3) și sintetizat de Invitrogen (Beijing, China). Metodele de extracție a ARN și PCR cantitativ în timp real (qRT-PCR) sunt descrise în publicațiile noastre anterioare. qRT-PCR a fost efectuat folosind un kit RT-PCR SYBR® PrimeScript® cu un singur pas (Takara Biotechnology Co., Ltd., Dalian, China). Amplificarea a fost realizată folosind un ciclist termic BIO – Rad iCycler (BIO-RAD, Hercules, CA, SUA). Nivelurile relative de expresie a ARNm au fost determinate folosind metoda pragului critic comparativ (Ct) (într-un tub separat)., Gena β-actină de menaj a fost utilizată ca control pentru normalizare.

Western blot

Western blot analize ale intestinului subțire de țesut și celule de cultură au fost efectuate după cum este descris anterior . Cantități echivalente de proteine din fiecare probă au fost preparate și separate folosind SDS-PAGE (geluri 12%) urmate de electrotransfer în membrane PVDF., Membranele au fost incubate cu soluție blocantă (soluție salină tamponată cu Tris, 8% lapte uscat fără grăsimi) timp de 2 ore, urmată de incubare cu anticorpi specifici la 4 °C peste noapte. Membranele s-au spălat pe scară largă în TBST (Tris-o soluție salină tamponată cu Tween, care conține 0.5% Tween-20, în TBS) și incubate cu peroxidază din hrean-conjugat anticorpi secundari în TBST pentru 1 sec. Membranele au fost spălate în continuare în TBST, și trupe au fost detectate folosind chemiluminiscență de detectare a agenților. A fost efectuată densitometria blotului, iar benzile au fost analizate folosind software-ul ImageJ., Anticorpi vizează apical dependente de sodiu acid biliar transporter (ASBT), ileum legarea acizilor biliari proteine (I-BABP) și organice dizolvate transporter α/β (Osta/β) au fost achiziționate de la Abcam (Cambridge, marea BRITANIE). Anticorpii secundari împotriva IgG de capră au fost obținuți de la Sun Biomedical Technology Co. (Beijing, China).țesutul ileon fixat cu paraformaldehidă tamponată de 4% a fost încorporat în parafină și au fost preparate secțiuni groase de 4 µm. Secțiunile au fost deparafinizate și stinse în 3% H2O2 timp de 15 minute pentru a bloca peroxidaza endogenă., Secțiunile au fost spălate cu PBS și incubate cu un anti-am-BABP de anticorpi în PBS (1:50 diluare) timp de 1 h la temperatura de 37 °C. O FITC-conjugat (izotiocianat de fluoresceină) de anticorpi a fost adăugat la un 1:50 diluare și se incubează timp de 0,5 h la 37 °C. Secțiunile au fost spălate, și PI (iodură de propidiu) a fost folosit pentru a pata nuclee. I-BABP a fost fotografiat folosind un microscop fluorescent (BX60, Olympus, Ina, Japonia). I-BABP a fost observată ca fluorescență verde, iar nucleul a fost observat ca fluorescență roșie .,

cultura celulară Caco-2

linia celulară Caco-2 a fost obținută de la Centrul de resurse celulare, Peking Union Medical College (care este sediul infrastructurii naționale a resurselor liniei celulare) pe Sept. 20, 2016. PCR și cultura au confirmat că linia celulară a fost verificată fără contaminare cu micoplasme. Originea speciilor acestor celule a fost confirmată prin PCR. Identitatea liniei celulare a fost autentificată folosind profilarea STR (FBI, CODIS) . Toate rezultatele sunt disponibile pe site (http://cellresource.cn)., Celulele Caco-2 au fost cultivate în mediul Eagle modificat al Dulbecco (DMEM) conținând 10% ser fetal bovin (FBS), 1% penicilină-streptomicină și 1% aminoacizi neesențiali. Celulele Caco-2 au fost menținute la 37 °C într-o atmosferă umidificată conținând 5% CO2 și 95% Aer. Mediul a fost schimbat la fiecare 2 zile. DMEM, FBS, 1% aminoacizi neesențiali și alte materiale au fost achiziționate de la infrastructura națională a resurselor liniei celulare (Beijing, China) sau Sigma-Aldrich (St.Louis, MO, SUA).,

testul permeabilității acidului caprilic prin Monostraturile celulare Caco-2

pentru experimentele de reabsorbție a acidului biliar, referindu-se la raportul lui Y. Wang și colab. , celulele au fost însămânțate și cultivate pe inserții de culturi celulare agățate Millicell (0.4 µm, Millipore, Molsheim, Franța) timp de 21 de zile pentru a obține monostraturi celulare confluente și foarte diferențiate. Formarea monostraturilor epiteliale funcționale a fost monitorizată prin măsurarea rezistenței electrice transepiteliale (TEER) folosind un contor Millicell-ERS (Millipore) înainte de experimente., Morfologia celulară a fost observată cu ajutorul unui microscop electronic, iar permeabilitatea a fost determinată folosind Lucifer Galben (Sigma, MO, SUA) ca marker.

prepararea acizilor grași și a CA a fost efectuată așa cum este descris de X. Zhang și colab. . Acizi grași și CA au fost măsurate și se dizolvă în etanol, apoi au fost diluate cu mediu de cultură celulară conținând 20 mg/L endotoxină-gratuit BSA până la o concentrație finală de 50, 100 sau 200 µmol/L (etanol< 0.1%). Acizii grași dizolvați și CA au fost incubați într-o baie de apă la 37 °C timp de 1 oră înainte de adăugarea în celule., Acidul caprilic (C8:0), acidul capric (C10:0), acidul stearic (C18:0) și acidul oleic (C18: 1) au fost achiziționate de la Sigma-Aldrich (St.Louis, MO, SUA).laturile apicale (AP) și bazolaterale (bl) ale monostratului au fost spălate cu soluția de sare echilibrată a lui Hank (HBSS) și echilibrate în mediu complet fără ser timp de 15 min. Mediu în AP a fost înlocuit cu mediu proaspăt conține CA (200 µmmol/L) sau amestecat cu unul de acizi grași (C8:0 C10:0, C18:0 sau C18:1), la 50, 100 sau 200 µmol/L., Viabilitatea celulară a celulelor Caco-2 în diferite condiții a fost evaluată prin testul de citotoxicitate celulară WST-1 (Fig. 1). Mediul cu unul dintre acizii grași a fost definit ca grupul”C8:0, C10:0, C18:0 sau C18:1″. „Grupul de control „nu conținea acizi grași, iar” grupul gol ” nu avea CA și acizi grași. Numai mediul proaspăt a fost utilizat în BL. Mediile de pe laturile AP și BL au fost eliminate 2 h mai târziu și stocate pentru analize de CA folosind HPLC-ms., Aparent permeabilitate (Papp) a fost calculată folosind următoarea ecuație: Papp = dQ/dt× 1/C0A (dQ este compus apariția în compartimentul receptor, dt este timpul, C0 este concentrația în compartiment donor, iar a este suprafața de inserare).

m-BABP nivelul de exprimare în Caco-2 celule

Caco-2 celule au fost însămânțate într-un 6-ei bine placa (Corning, NY, statele UNITE ale americii) și de cultură la un total de confluența cu mare diferențiere pentru a confirma efectele MCFAs pe I-BABP . Mediul de cultură a fost înlocuit înainte de experimente cu mediu care conține FBS delipidizat timp de 24 de ore., Celulele au fost spălate cu gheață-rece fosfat salin (PBS) și incubate cu mediu proaspăt conțin CA la 200 µmol/L (definite ca grup) sau CA amestecat cu unul de acizi grași (C8:0 C10:0, C18:0 sau C18:1) la 200 µmol/L (definită ca „C8:0+CA, C10:0+CA, C18:0+CA sau C18:1+CA grup”) sau C8:Sau 0 C10:0 la 200 µmol/L, fără CA (definit ca „C8:0 grup și C10:0 group”) pentru 24 h. Și gol grup a fost fără acizi grași și CA. Mediul a fost îndepărtat, iar celulele au fost spălate de trei ori cu PBS rece ca gheața., ARN-ul Total și proteina au fost izolate și colectate pentru analize suplimentare ale ARNm i-BABP și ale nivelurilor de expresie a proteinei.

analiză statistică

toate datele sunt exprimate ca medie ± DS. Datele au fost analizate folosind analiza unidirecțională a varianței, urmată de testul t independent pentru a determina semnificația diferenței dintre grupuri folosind software-ul SPSS versiunea 17.0. P < 0, 05 a fost considerat semnificativ statistic.