Anticorpii sunt imunoglobuline (Ig) glicoproteine produse de celulele plasmatice (celulele B) ca răspuns la externe molecule antigenice (immunogens). Funcția principală a anticorpilor este de a se lega în mod specific de aceste antigene străine pentru a le dezactiva și/sau a le marca pentru distrugere de către sistemul imunitar, protejând astfel gazda de infecție. Există mai multe clase de anticorpi., Prima parte a acestui rezumat se concentrează asupra anticorpilor convenționali de dimensiuni complete, anticorpii din clasa IgG și IgM, care sunt puternic utilizați într-o multitudine de aplicații biomedicale de cercetare, diagnostic și terapeutice.unitatea de bază a unui anticorp convențional este o unitate de patru polipeptide formată din două lanțuri grele identice și două lanțuri ușoare identice ținute împreună prin legături disulfidice. Lanțurile ușoare sunt mai scurte, cu greutăți moleculare mai mici decât lanțurile grele., Forma generală a unui anticorp este un Y, cu o balama flexibila (interdomain) regiune la centrul de Y. flexibilitatea interdomain regiunea balama este important pentru bivalentă de legare al unui anticorp , care permite două buzunare obligatorii pentru a interacționa cu site-uri antigenice la distanțe variabile. Fiecare lanț polipeptidic are o regiune constantă, care nu variază semnificativ între anticorpi și o regiune variabilă, care este specifică fiecărui anticorp particular. Notația comună pentru regiunea variabilă a lanțului ușor este VL, iar pentru regiunea constantă a lanțului ușor este CL (Figura 1)., Notația este similară pentru variabila lanțului greu (VH) și regiunile constante (CH) cu CH1, CH2 și CH3 care denotă diferitele domenii de regiune constante ale lanțului greu. Carbohidrații sunt în mod normal atașați la domeniile CH2 ale lanțurilor grele. Regiunea fragment cristalizabilă (Fc) conține numai regiuni constante din lanțurile grele (CH), dar regiunea de legare a antigenului fragmentului (Fab) include atât un domeniu constant, cât și domeniile variabile ale lanțurilor grele și ușoare (VH și CL). Regiunea variabilă fragment FV region conține numai cele două domenii variabile (Figura 1)., Vezi anticorpul de șoarece pentru discuții privind izotipurile imunoglobulinelor, subclasele și numărul de domenii de imunoglobulină.
fiecare anticorp complet are două buzunare de legare a antigenului, situate în regiunile FV și se pot lega de două antigene (legare bivalentă)., Cu toate acestea, dacă cele două antigene sunt prea apropiate (≤3 nm) sau prea îndepărtate (≥29nm), anticorpul se poate lega doar de un antigen (legare monovalentă) . Există o schimbare semnificativă de afinitate între legăturile monovalente și bivalente, cu o modificare de 1.500 de ori a valorilor Kd .structura anticorpilor specifici este disponibilă din Baza de date a anticorpilor structurali (SAbDab), o bază de date curată a structurilor de anticorpi disponibile public, precum și instrumente de modelare structurală, care este actualizată săptămânal din Banca de date proteice (PDB).,
Convenționale full-size anticorpi au fost utilizate în cercetare pentru detectarea de proteine prin Western blot analize , imunohistochimie , și de imunoabsorbție enzimatică (ELISA) de zeci de ani. Anticorpii de dimensiuni mari au fost, de asemenea, dezvoltați pentru aplicații de diagnosticare, cum ar fi testele de sarcină și detectarea bacteriilor și virusurilor în sânge, cum ar fi un ELISA care detectează HIV. În plus, anticorpii convenționali de mărime completă sunt utilizați frecvent în terapia bolilor., De exemplu, Infliximab este un anticorp din multe disponibile care recunosc factorul de necroză tumorală alfa (TNFa) și este utilizat în tratamentul bolii Crohn și artritei reumatoide . Trastuzumab sau Herceptin este un anticorp care se leagă de receptorul 2 al factorului de creștere epidermal și este utilizat în tratamentul cancerului de sân metastatic . Există, de asemenea , mai multe terapii pe bază de anticorpi, inclusiv Muromonab, administrate primitorilor de transplant pentru a preveni rejetul alogrefei.,deși anticorpii convenționali de mărime completă pot fi utilizați pentru aplicații terapeutice, există avantaje și dezavantaje în utilizarea anticorpului complet. Un avantaj important al anticorpilor convenționali este faptul că regiunea Fc angajează răspunsul imun al organismului și poate viza antigeni legați pentru distrugere. Această regiune Fc poate fi, de asemenea, un dezavantaj în unele aplicații clinice, deoarece răspunsul imun pe care îl provoacă de obicei poate fi în detrimentul sănătății pacientului., În plus, anticorpii de dimensiuni mari nu pot pătrunde bine în anumite țesuturi datorită dimensiunilor lor relativ mari . În unele cazuri, atunci când se utilizează anticorpi de dimensiuni mari pentru aplicații de diagnosticare, domeniul Fc poate provoca o legare nespecifică semnificativă, ceea ce poate afecta aplicațiile de detectare.
pentru multe aplicații fragmente de anticorpi sunt de preferat. Fragmentele de anticorpi pot fi produse prin mecanisme chimice sau genetice., Fragmentarea chimică utilizează agenți reducători pentru a rupe legăturile disulfidice din regiunea balamalei și digestia anticorpului cu proteaze, inclusiv pepsină, papaină și ficină. Construcția genetică a fragmentelor oferă posibilitatea de a crea o multitudine de molecule care conțin fragmente, fiecare cu caracteristici unice de legare și funcționale.digestia chimică și proteazică a anticorpilor IgG sau IgM de dimensiuni mari produce fragmente de legare a antigenului (Fab; Figura 1) și fragmente Fc, compuse numai din lanțurile grele CH2 și CH3 domenii., Metodele biochimice de generare a fragmentelor de anticorpi produc instrumente utile pentru aplicații diagnostice și terapeutice, dar este destul de laborioasă și necesită o cantitate mare de materie primă de anticorpi.
fragmentele de legare a antigenului produse de digestia biochimică includ Fab, (Fab’)2, Fab’ și FV, toate din care nu au Regiunea Fc. Fragmentele F(ab) monovalente au un situs de legare a antigenului, în timp ce fragmentele bivalente (Fab’)2 au două regiuni de legare a antigenului care sunt legate prin legături disulfidice., Două fragmente individuale F (ab) sunt produse atunci când un anticorp de dimensiune completă este digerat cu enzima papaină. Un fragment F(ab’)2, care reține o porțiune din regiunea balamalei, este produs prin digestia pepsinei a anticorpilor IgG sau IgM. Reducerea fragmentelor F(ab’)2 produce 2 fragmente monovalente fab’, care au o grupare sulfhidril Liberă Care este utilă pentru conjugarea cu alte molecule. Fragmentele FV sunt cel mai mic fragment obținut din scindarea enzimatică a anticorpilor din clasa IgG și IgM (Figura 1)., Fragmentele FV au situsul de legare a antigenului format din regiunile VH și VL, dar le lipsesc regiunile constante ale regiunilor Fab (CH1 și CL) (Figura 1, panoul din dreapta). VH și VL sunt ținute împreună în fragmente FV prin interacțiuni non-covalente. Fragmentele pot fi generate prin kituri disponibile în comerț, de exemplu, kitul de fragmentare F(ab’)2 de la G-Biosciences .,
metode de inginerie Genetică permite producerea de singur lanț variabil de fragmente (scFv), care sunt de tip FV fragmente care constau al VH și VL domenii legate printr-o inginerie flexibil linker peptidice (Figura 1) . Manipularea orientării domeniilor V și a lungimii legăturii creează diferite forme de molecule FV . Când legătura are cel puțin 12 reziduuri lungi, fragmentele scFv sunt în principal monomerice (așa cum se arată în Figura 1) ., Linkerii care sunt 3-11 reziduuri cu randament lung molecule scFv care nu sunt în măsură să se plieze într-un domeniu funcțional FV. Aceste molecule se asociază cu o a doua moleculă scFv, care creează un diabody bivalent . Dacă linker lungime este mai mică de trei reziduuri, scFv molecule asociat în triabodies sau tetrabodies . De exemplu, Tao Y et al a generat o VH-VL diabody cu un scurt GGGGS linker și scFv cu mult GTTAASGSSGGSSSGA linker ., Multivalente scFvs posedă funcțională mai mare afinitate de legare a lor antigene țintă ca urmare a două țintă antigen binding site-uri, ceea ce reduce off-rata de fragment de anticorp . Minicorpii sunt proteine de fuziune scFv-CH3 care se asamblează în dimeri bivalenți . Mici scFv fragmente cu diferite variabile domenii pot fi generate pentru a produce bispecific bis-scFv fragmente capabile de legare a două tipuri diferite de epitopi concomitent . Metodele genetice sunt, de asemenea, folosit pentru a crea bispecific Fab dimeri (Fab2) și trispecific Fab trimeri (Fab3) ., Aceste fragmente de anticorpi sunt capabile să lege simultan 2 sau 3 antigene diferite.
În plus față de convenționale anticorpi, camelidă și rechin (squalidae) specii conțin un subset de ciudat Lanț Greu de Anticorpi (hcAb) compuse exclusiv de lanț greu homodimers lipsit de lanțuri ușoare . Porțiunile Fab ale acestor anticorpi, numite VHH la camelide și VNAR la rechini, sunt cele mai mici regiuni de legare a antigenului găsite în mod natural ., Nanobodies sunt VHH-recombinant derivat domenii capabil de a lega antigene, de multe ori clonat din VHH fagul biblioteci, cum ar fi cele împotriva betacoronarivus S proteine . Termodinamica și structurile lor de legare au fost studiate ( și de referință în acestea)., Nanobodies sunt foarte stabile și pot fi ușor produsă în cantitate mare prin utilizarea în comun proteine simple sisteme de expresie, cum ar fi bacterii (funcțional convenționale full-size anticorpi sunt dificil să-și exprime în mod corespunzător într-un bacteriană sistem), reprezentând astfel un instrument promițător pentru cercetare și pentru scopuri terapeutice, mai ales în zonele de super-rezoluție microscopia, spectrometria de masă, și vizate de proteine de degradare . Nanocorpii pot fi , de asemenea , livrați în interiorul celulelor vii prin conjugare cu peptide sau in vivo sau exprimați direct in vivo și recunosc țintele sale in vivo., Nanobodies împotriva RFP sau GFP, când conjugat cu mult-roșu Atto coloranți, atins 118 ori mărire de semnale fluorescente peste GFP sau RFP, și au fost folosite pentru a genera întregului corp mouse-ul neuronale de conectivitate . De asemenea, au fost utilizate pentru a stabiliza starea activă a proteinelor în studiile structurale . Un sistem de Expresie cu nanocorpi concatenați multipli împotriva diferitelor tulpini de gripă este examinat ca mijloc de generare a unui vaccin antigripal universal ., Nanocorpii secundari anti-IgG recombinanți au un mare potențial de a înlocui anticorpii secundari policlonali utilizați pe scară largă, produși cu ajutorul animalelor .
Nanobodies au capacitatea unică de a traversa bariera hemato-encefalică ; cu toate acestea, nanobodies tind să fie procesate și eliminate foarte repede din organism . Nanobodies poate fi folosit pentru metode ca immunoprecipitation, de exemplu, RFP-Capcană MA din Chromotek , sau cuplate la proteine fluorescente pentru a urmări țintele intracelular în celulele vii în timp real .,aproximativ 10% din imunoglobulinele bovine conțin o a treia regiune neobișnuit de lungă de determinare a complementarității lanțului greu (CDR 3h) cu un număr mare de reziduuri de cisteină . Aceste cisteine pereche pentru a forma legături disulfidice care duce la o tulpină-și-buton ca structura în domeniul de legare antigen . Acest domeniu cdr3h excepțional de lung, cu tulpină lungă, contribuie la diversitatea specificității anticorpilor bovini.,
Intrabodies, sau intracelular anticorpi, se referă la anticorpi sau fragmentele lor (de obicei de scFv design) și-a exprimat direct în interiorul celulelor sau la animale in vivo printr-o expresie vector. De exemplu, Dong JX et al a dezvoltat mai mulți nanocorpi împotriva proteinelor neuronale pentru expresia intracelulară ca intracorpi . Un aspect important/Avertisment este reducerea mediului intracelular care diminuează afinitatea unui anticorp sau a unui fragment de anticorp a cărui legare cu antigenul depinde de legăturile disulfidice intradominale., Un alt considerent este că intracorpii tind să se agregeze. Kabayama H et al proiectate intrabodies cu o plasă engative percepe chiar și la cel mai mic citoplasmatice pH 6.6 pentru a genera ultra-stabil citoplasmatice anticorpi . Intraborpii sunt utilizați ca alternative la inhibitorii farmacologici pentru a viza participanții endocitari specifici., Pentru cazuri, expresia de o singură variabilă a lanțurilor fragment (scFv) derivat din 3B12A anticorp monoclonal împotriva TDP-43 nuclear export signal în HEK293A celule sau după in utero electroporarea expresia vectorială a promovat proteoliza de TDP-43 agregate in culturi de celule embrionare și creier de șoarece ., Virus mediate de livrare în sistemul nervos de o scFv anticorpi împotriva ARN recunoașterea motiv 1 din TDP-43 redus microgliosis într-un model de mouse-ul de acută neuroinflammation și atenuate tulburari cognitive, motorii defecte, TDP-43 proteinopathy, și neuroinflammation la șoareci transgenici care exprimă TDP-43 mutațiile legate de scleroză laterală amiotrofică . Potențialul intrakorpilor ca modalitate terapeutică rămâne să apară.
un fragment de anticorp poate fi, de asemenea , legat cu o etichetă de import de celule, cum ar fi o etichetă IPTD, pentru a facilita intrarea sa în celule.,
fragmente de anticorpi oferă anumite avantaje față de un anticorp full-size pentru unele aplicații. Acest subiect a fost revizuit de Nelson . Un avantaj al fragmentelor față de anticorpii de dimensiune completă este că fragmentele de anticorpi sunt mai mici decât anticorpii convenționali și, în general, nu au glicozilare, permițând producerea lor în sisteme de Expresie procariote, care asigură economii de timp și Costuri., În plus, fragmentele sunt suficient de mici pentru a se infiltra în unele țesuturi pe care anticorpii de dimensiuni mari nu le pot penetra, ceea ce ajută la multe proceduri terapeutice și imunohistochimice . Mai mult, lipsa domeniului Fc este un avantaj substanțial pentru anticorpii primari utilizați în imunohistochimie și alte aplicații de detectare, deoarece au redus foarte mult legarea nespecifică la receptorul Fc. Un scFv care este frecvent utilizat în diagnosticare este anticorpul NC10 împotriva neuraminidazei gripale., Anticorpul MOC – 31 împotriva moleculei de adeziune a celulelor epiteliale Ep-CAM este un scFv utilizat în mod obișnuit ca terapie pentru cancer. Diabodiile, triabodiile și tetracorpii au utilizări potențiale în aplicații precum radioimunoterapia și imagistica de diagnostic in vivo . Cu toate acestea , fragmentele care nu au domeniul Fc sunt degradate în organism mult mai rapid decât anticorpii convenționali și nu pot provoca procese citotoxice mediate de Fc decât dacă sunt conjugate cu o fracțiune efectoare , ceea ce necesită o optimizare suplimentară pentru terapia bazată pe fragmente de anticorpi., deși diferite fragmente de anticorpi oferă anumite avantaje, ele nu sunt utilizate în mod obișnuit în experimente. În cele peste 60.000 de articole realizate manual de Labome, doar câteva articole au citat aplicații ale fragmentelor de anticorpi Fab. La Roche anti-digoxigenin Fab fragmentele de anticorpi ( 11093274910) și anti-fluoresceină Fab fragmentele de anticorpi ( 11426338910) sunt generate în oi și a produs prin digestia cu papaină. Fragmentele fab anti-digoxigenin au fost utilizate pentru hibridizări in situ, deoarece sondele ARN sunt etichetate cu digoxigenin ., Ei au fost, de asemenea, utilizați pentru a efectua analiza de pliere a proteinelor pentru a studia procesul de pliere a moleculei de calmodulină unică prin spectroscopia forței cu o singură moleculă . F(ab) fragmente de anti-mouse-ul secundar anticorpi sunt adesea folosite pentru a bloca endogene mouse-Ig timpul imunocolorarea, de exemplu, AffiniPure Fab fragment Măgar antimouse IgG din Biozol (JIM-715-007-003) .,
Invitrogen Alexa Fluor 546-conjugat capra anti-IgG de iepure F(ab’)2 fragment a fost folosit pentru a efectua imunohistochimie pentru a investiga rolul de sFLT-1 în menținerea realizărilor fotoreceptoare strat în modele de mouse-ul și Invitrogen Alexa Fluor 488 (Fab’)2 fragment de iepure anti-capra IgG (H+L) a fost folosit în imunohistochimie pentru a investiga mecanismul de sfat link-ul de regenerare în auditiv celule de par .,receptorii Fc (FCR) sunt molecule exprimate în principal pe/în celulele imune înnăscute, care recunosc și leagă domeniul FC al anticorpilor și, prin urmare, inițiază un răspuns imun bazat pe celule. Funcțiile diverse ale FcRs reflectă gama largă de roluri protectoare sau modulatoare ale anticorpilor, inclusiv medierea neutralizării și clearance-ului substraturilor vizate, precum și programarea imunității adaptive ., Funcțiile biologice ale FcRs sunt reglementate de immunoreceptor tirozin-activare pe bază de motive (ITAMs) și immunoreceptor tirozina pe bază de inhibitor motive (ITIMs), care acționează ca receptori de interfață cu activatoare și inhibitoare căi de semnalizare, respectiv. Astfel, de semnalizare, de ITAMs poate provoca activarea celulelor, fagocitoza și endocitoză, întrucât semnalizare de ITIMs are un efect inhibitor asupra celulelor de activare . FCR-urile au fost descrise pentru toate clasele de imunoglobuline, iar unele dintre ele sunt discutate mai jos.,această familie include FcyRI, FcyRII, FcyRIII și izoformele lor. Aceștia sunt responsabili de citotoxicitatea mediată de celule dependentă de anticorpi (ADCC) și de fagocitoza mediată de celule dependentă de anticorpi (ACDP) .un alt receptor care leagă IgG este receptorul Fc neonatal (FcRn), care este implicat în transferul imunității umorale pasive de la mamă la făt. FcRn protejează, de asemenea, IgG de degradare in vivo, explicând timpul lor de înjumătățire lung în ser ., Acest fenomen a dus la dezvoltarea unor anticorpi terapeutici mai buni prin introducerea unor modificări în regiunea Fc pentru a promova interacțiunea Fc-FcRn.acestea includ FceRI cu afinitate ridicată, care este capabil să lege IgE monomeric, și fcerii de tip C cu afinitate scăzută, care interacționează preferențial cu IgE complex. FceRI mediază răspunsul imediat de hipersensibilitate al multor reacții alergice prin stimularea degranulării și eliberarea unei serii de mediatori inflamatori pe mastocite și bazofile ., FceRII există atât într-un membranei-legat de formă, care oferă un creand semnal pentru sinteza IgE , precum și fragmente solubile care generează un opuse upregulation pe sinteza IgE . Rolul său în transcitoza complexelor IgE-alergen în căile respiratorii umane și epiteliul intestinal este investigat în mod activ ca o țintă potențială pentru inflamația alergică a căilor respiratorii ca urmare a alergiilor alimentare .
singurul membru al grupului receptorilor IgA, FcaRI, este exprimat numai în celulele liniei mieloide., Acesta joacă un rol atât în răspunsurile pro – cât și antiinflamatorii, în funcție de starea legării IgA. În timp ce legarea IgA secretorie (SIgA) prezentă la locurile mucoasei are efecte antiinflamatorii, inclusiv prevenirea invaziei patogene, legarea IgA serică duce la răspunsuri inflamatorii. FcaRI reglementează, de asemenea, viabilitatea neutrofilelor în funcție de micromediul inflamator . TRIM21 TRIM21 se poate distinge de alte FCR – uri, deoarece prezintă o specificitate largă a anticorpilor. Se poate lega IgG, IgM și IgA . Este, de asemenea, exprimat de celulele celor mai multe linii histogene ., TRIM21 participă la interferența mediată de anticorpi a replicării virale prin direcționarea complexelor citosolice virus-anticorp pentru degradarea proteazomală.legarea domeniilor Fc la FCR poate avea efecte nedorite în metodele analitice monoclonale bazate pe anticorpi, cum ar fi imunohistochimia (IHC), sortarea celulelor activate prin fluorescență (FACS) și imunoprecipitarea cromatinei (ChIP). Legarea nespecifică la FCR poate introduce zgomot de fond care poate duce la detectarea falselor pozitive., Soluțiile pentru a face față acestei probleme includ utilizarea controalelor izotipului (i) pentru închiderea, serul (ii) pentru a concura în linii mari pentru receptorii implicați în legarea nespecifică sau IgG purificat (iii) pentru a bloca receptorii Fc în mod specific . Innovex Fc blocant al Receptorilor #NB309 poate fi folosit la bloc de parafină sau congelate secțiuni timpul IHC sau IC experimente sau BD Biosciences #553142 , Miltenyi Biotec receptorilor Fc bloc de citometrie în flux. De exemplu, Chopra S et al blocat FcyR obligatorii cu 5 µg/ml TruStain fcX (anti-mouse-ul CD16/32, clona 93) din BioLegend timpul citometrie în flux și celule de sortare .,
Dr. Macarena Fritz Kelly de la São José dos Campos, SP, Brazilia, a contribuit la secțiunea Despre receptorii Fc în septembrie, 2018.
Lasă un răspuns