Evoluția de Adâncime Gulper Eel Mitocondrial Genomul: Scară Largă Ale Genei Originea În Țipari

Abstract

studii Recente au demonstrat că abaterile de la tipic vertebrate genei mitocondriale ordine sunt mult mai frecvente decât se credea inițial., Astfel de abateri, cu toate acestea, sunt minore, cu inversiuni și/sau translocații de câteva gene fiind implicate și tandem duplicarea genei regiuni urmată de eliminări de gene au fost invocate ca mecanisme provenite din astfel de roman gene ordine., În cursul filogenetică moleculară studii privind Elopomorpha (țipari și aliații lor), am constatat că genomul mitocondrial (mitogenomes) din cele două adâncime țipari lacomi, Eurypharynx pelecanoides (Eurypharyngidae) și Saccopharynx lavenbergi (Saccopharyngidae), prezintă un identice gene pentru care este foarte diferit de acela al altor vertebrate. Analiza filogenetică folosind mitogenomic date de la 59 de specii de pește nu a confirmat doar o singură origine a unei gene comanda cu încredere, dar, de asemenea, a precizat că a fost derivat de la tipic vertebrate gene ordine., Comparații detaliate gulper eel gene scopul cu care a tipic vertebrate sugerat că apariția un singur pas, pe scară largă duplicarea genei regiunea de prelungire >12 kb, urmată de eliminări de gene intr-un strămoș comun al celor două specii, cele mai multe în mod parcimonios conturi pentru acest neobișnuit gene aranjament.

Introducere

Vertebrate genei mitocondriale scopul a fost considerat inițial conservator pentru a finaliza secvențe de nucleotide din genomul mitocondrial (mitogenomes) de la mamifere (Anderson et al. 1981, 1982; Bibb și colab., 1981) și broasca africană cu gheare (Roe et al . 1985) a arătat o ordine comună a genelor. Ca complet ADN-ul mitocondrial (mtDNA) secvențe au fost determinate pentru un număr de vertebrate (269 specii de 11 iunie 2003; Centrul National pentru Biotehnologie, pentru Informare site-ul Web: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PMGifs/Genomes/7742.html), a fost recunoscut faptul că abaterile de la tipic gene pentru nu sunt atât de rare în vertebrate (fig. 1; Boore 1999). Cu excepția mamiferelor placentare, exemplele includ toate liniile majore de vertebrate, cum ar fi lampreys (Lee and Kocher 1995), amfibieni (Macey et al. 1997; Sumida și colab., 2001), reptile (Kumazawa and Nishida 1995; Quinn and Mindell 1996; Macey et al. 1997), păsări (Desjardins și Morais 1990, 1991; Quinn și Wilson, 1993; Mindell, Sorenson, și Dimcheff 1998), marsupiale (Pääbo et al. 1991; Janke și colab. 1994) și fish (Miya și Nishida 1999; Inoue și colab. 2001b; Miya, Kawaguchi, and Nishida 2001). Cu toate acestea, astfel de rearanjări genetice sunt locale (mai ales în cadrul unui grup de gene Tarn) și nu a fost găsit niciun exemplu care să implice rearanjări la scară genomică.,

țipari lacomi sunt bine-cunoscute creaturi de adâncime, în mod colectiv, inclusiv patru familii plasate în ordinea Saccopharyngiformes, care apar la bathypelagic adâncimi (>1000 m) de-a lungul oceanelor lumii (Bertelsen, Nielsen, și Smith, 1989). Aspectul lor bizar (fig. 1), care rezultă din gapes extrem de lărgite, deformate la vârful capului și corpului de șarpe al anghilei, a atras multă atenție din partea multor cercetători (de exemplu, Bertelsen, Nielsen, and Smith 1989; Robins 1989)., Astfel specialitate caracteristici anatomice au condus pe anchetatori să presupunem că filogenetice poziții de aceste animale sunt în afara pește osos (de exemplu, Tchernavin 1946), deși acestea au fost, în general, considerat a fi rude apropiate de adevărata anghile (pentru Anguilliformes), deoarece acestea au o frunze ca leptocephalous stadiul larvar (Greenwood et al. 1966; Inoue and Miya 2001).,

în cursul filogenetică moleculară studii de Elopomorpha (țipari și aliații lor), folosind mitogenomic date, am găsit o neobișnuită genei mitocondriale pentru unul din țipari lacomi, Eurypharynx pelecanoides (fig. 1). Acest articol descrie romanul gene organizație în mitogenomes de două specii de țipari lacomi, E. pelecanoides și Saccopharynx lavenbergi. Am angajat o reacție în lanț a polimerazei (PCR)-abordare bazată dezvoltat de Miya și Nishida (1999) pentru secvențierea completă mitogenomes a acestor pesti., Pentru a explora originea acestor unic mitogenomes, ne-am supus mitogenomic de date pentru analiza filogenetică, și vom discuta aici posibilele mecanisme generatoare de astfel de gene aranjament în doi țipari lacomi.

materiale și metode

specimene

secvențele ADN mitocondriale au fost obținute de la șase indivizi din două specii reprezentând două familii în Ordinul Saccopharyngiformes (Robins 1989). Pentru familia monotipică Eurypharyngidae, un individ de E., pelecanoides a fost folosit ca specimen pentru determinarea secvenței complete mtDNA, iar ceilalți patru indivizi, inclusiv două larve leptocefale, au fost utilizați pentru determinarea secvențelor parțiale a patru joncțiuni genetice majore (fig. 2) pentru a confirma ordinea genei în mitogenomul E. pelecanoides. Pentru familia Saccopharyngidae, un singur individ de S. lavenbergi a fost folosit ca specimen pentru determinarea secvenței mtDNA complete., Voucher exemplare au fost depuse în pește colecții de la Muzeul de Istorie Naturală & Institutul, Chiba, Japonia (CBM-ZF), și de la Universitatea din Washington (UW): E. pelecanoides (CBM-ZF 10311: Hyuga-Nada, sudul Japoniei; MC-ZF 10312, 10313, 10316, și 10317: ecuatorială centrală a Oceanului Pacific) și S. lavenbergi (UW 045633: Pacificul de Est).

extracția ADN

o porțiune a musculaturii epaxiale (ca. 0,25 g) a fost excizată din specimene proaspete din fiecare specie și conservată imediat în etanol 99,5%., ADN-ul genomic total a fost extras folosind kitul de țesut Qiagen QIAamp, conform protocolului producătorului.

Reacție în Lanț a Polimerazei și Secvențierea

întreaga mitogenomes de doi țipari lacomi au fost amplificate folosind o lungă tehnica PCR (Cheng, Higuchi, și Stoneking 1994). Cinci pește-universal și trei specii specifice lung primeri PCR (E-LA-16-L + H12293-Leu și L12321-Leu + E-LA-16-H E. pelecanoides; L2508–16 + Sala-ND4-H și Sala-CO1-L + Sala-ND1-H pentru S. lavenbergi; fig. 1) au fost folosite pentru a amplifica întregul mitogenom al fiecărui anghilă în două reacții., Întreaga mitogenomes de alte patru E. pelecanoides persoane au fost amplificate cu trei pește-amorse universale și o singură specie-specifice lung-PCR primer (L2508–16 + Eupe-ND2-H și L12321-Leu + E-LA-16-H). Patru specii-primeri specifici (Eupe-ND2-H E. pelecanoides; Sala-CO1-L, Sala-ND1-H, și Sala-ND4-H pentru S. lavenbergi) au fost alternativ proiectat cu referință parțiale secvențe de nucleotide din ND2 gene de E. pelecanoides și COI, ND1, și ND4 gene de S. lavenbergi determinat de fiecare totală de ADN, folosind pește-amorse universale.,

timp-PCR au fost diluat cu TE buffer (1:20) pentru a fi utilizat ulterior ca PCR template-uri, cu excepția pentru o regiune care intervin între cele două lung-primeri PCR (între E-LA-16-H și S-LA-16-L, și H12293-Leu și L12321 Lei pentru E. pelecanoides; fig. 1), în care ADN-ul genomic total a fost utilizat alternativ.un total de 82 de pești-primeri universali (Miya și Nishida 1999, 2000; Inoue et al., 2000, 2001a, 2001b, 2001c, 2001d; Ishiguro, Miya, și Nishida 2001; Kawaguchi, Miya, și Nishida 2001) au fost utilizate în diferite combinații pentru a amplifica învecinate, care se suprapun segmente de întreaga mitogenome pentru fiecare dintre cele două specii. Primerii specifici speciei au fost concepuți în cazurile în care nu erau disponibili primeri universali adecvați pentru pești. O listă de primeri PCR utilizate pentru o anumită specie este disponibil la J. G. I. la cerere. Reacțiile PCR lungi și PCR ulterioare au fost efectuate așa cum s-a descris anterior (de exemplu, Miya și Nishida 1999; Inoue et al. 2003).,produsele PCR dublu catenar, purificate folosind un kit de pre-secvențiere (USB), au fost ulterior utilizate pentru secvențierea directă a ciclului folosind terminatoare etichetate cu vopsea (Applied Biosystems). Grundurile utilizate au fost aceleași cu cele pentru PCR. Toate reacțiile de secvențiere au fost efectuate conform instrucțiunilor producătorului. Fragmentele etichetate au fost analizate cu ajutorul unui sequencer ADN model 377 (Biosystems Applied).secvențele ADN au fost analizate folosind programul de pachete software DNASIS versiunea 3.2 (Hitachi Software Engineering)., Locațiile celor 13 gene care codifică proteinele au fost determinate prin comparații ale ADN-ului sau secvențelor de aminoacizi ale mitogenomilor de pește osos. Cele 22 de gene Tarn au fost identificate prin structurile lor secundare trifoi (Kumazawa și Nishida 1993) și secvențe anticodon. Cele două gene rRNA au fost identificate prin similitudinea secvenței și structura secundară (Gutell, Gray, and Schnare 1993). Secvența de date sunt disponibile de la DDBJ/EMBL/GenBank cu numere de aderare AB046473 și AB046475–AB046490 pentru E. pelecanoides, și AB047825 pentru S. lavenbergi.,

analiza filogenetică

matricele de date de la Inoue și colab. (2001d) și Miya, Kawaguchi, and Nishida (2001) au fost combinate și taxoni redundante au fost eliminate. Mitogenomic secvențe din cele două țipari lacomi și două teleosts (Gymnothorax kidako, AP002976 și Salmo salar, U12143 ) au fost adăugate. Deoarece alinierea neechivocă a celor două gene ARNr pe baza modelelor de structură secundară nu a fost fezabilă (Miya și Nishida 2000), acestea nu au fost utilizate în analize., Gena ND6 nu a fost utilizată în analizele filogenetice din cauza compoziției sale de bază eterogene și a performanței filogenetice constant slabe (de exemplu, Zardoya and Meyer 1996; Miya and Nishida 2000). De asemenea, buclele Tarn, TRNASER(AGY) (structuri secundare inferioare instabile la unele specii) și alte regiuni aliniate ambiguu, cum ar fi capetele 5′ și 3′ ale mai multor gene care codifică proteine, au fost excluse din analize., În plus, 3 codonul poziții în proteine-codare gene care ar putea pozitiv induce în eroare o analiză de nivel superior relații de actinopterygians (Miya și Nishida 2000) au fost excluse din analize, lăsând 7,984 disponibile poziții de nucleotide din 12 proteine-codare gene și 21 de gene arnt.

Bayesian filogenetic analizele au fost efectuate folosind MrBayes 2.01 (Huelsenbeck și Ronquist 2001)., În general reversibile timp modelul cu unele site-uri presupuse a fi constante și variabile site-uri presupuse a urma un discret gamma distribution (GTR + I + Γ; Yang 1994) a fost selectat ca cel mai bine se potrivește modelul de substituție nucleotidică (ModelTest versiunea 3.06; Posada și Crandall 1998). Ne-am stabilit probabilitatea maximă parametri în MrBayes după cum urmează: „lset nst = 6” (GTR), „rate = invgamma” (I + Γ), și „basefreq = estimare” (estimat proporția de tipuri de bază de date). Procesul Monte Carlo al lanțului Markov a fost stabilit astfel încât patru lanțuri (trei încălzite și unul rece) să ruleze simultan., Am efectuat două runde independente pentru 1 milion de generații, cu arbori fiind prelevate la fiecare 100 de generații, fiecare dintre care a pornit de la un copac aleatoare. Două analize independente s-au convertit la scoruri log-probabilitate similare și au atins „staționaritatea” (lipsa îmbunătățirii scorurilor ML) la cel mult 120.000 de generații., Astfel, prima 1.200 de copaci au fost aruncate la fiecare analiză, iar restul de 17,602 combinate probe de la două analize independente au fost folosite pentru a genera un 50% regula majorității consens copac, cu procentul de probe recuperarea anumit grup reprezentând clade e probabilitatea posterioară (Huelsenbeck și Ronquist 2001).

Rezultate

Genomul Organizații

lungimea totală de E. pelecanoides și S. lavenbergi mitogenomes sunt 18,978 bp și 18,495 bp (cu excepția pentru o parte din prezumtiv regiunii de control pentru S., lavenbergi), respectiv (a se vedea materialul suplimentar online). Conținutul genomului acestor două anghile gulper include două rRNA, 22 Tarn și 13 gene care codifică proteinele, așa cum se găsește la alte vertebrate (fig. 2). De asemenea, ca și în cazul altor vertebrate, majoritatea genelor acestor două specii sunt codificate pe catena H, cu excepția genelor ND6 și opt tRNA. Toate caracteristicile sunt similare în lungime cu cele ale altor pești osoși, cu excepția genei COI și a regiunii de control pentru E. pelecanoides și a genelor COI și cyt b Pentru S., lavenbergi (aproximativ 100, 800, 150 și 30 bp mai lungi decât cele din alte pești osoși, respectiv).

E. pelecanoides mitogenome conține trei noncoding regiuni mai mult de 200 bp (fig. 2; a se vedea, de asemenea, materiale suplimentare online; Regiunea noncoding și regiunea de control ). La nc1, situat între tRNASer(UCN) și tRNAAsp gene, și nc2, situat între tRNAAsp sunt legate de gene, conțin două și patru pseudogene corespunzătoare pentru a degenerat copii de tRNAAsp gene, respectiv., O regiune necodificată (1818 bp) situată între genele cyt b și tRNAPhe pare să corespundă regiunii de control. S. lavenbergi mitogenome conține, de asemenea, trei noncoding regiuni mai mult de 200 bp (noncoding regiune și regiuni de control ). Nc, situat între tRNALeu(CUN) și ND5 gene, conține cel puțin două pseudogene corespunzătoare pentru a degenerat copii ale tRNALeu(CUN) gene., CR1 (992 bp), situat între două gene arnt clustere (TP și IM regiuni), și CR2 (> 837 bp), situat între cyt b și tRNAPhe gene, par a corespunde regiunii de control, și au complet identice secvențe de peste 800 de bp, care indică faptul că acestea sunt în curs concertate evoluție (a se vedea Kumazawa et al. 1998).

Cu excepția a două duplicat regiuni de control (CR1 și CR2) în S. lavenbergi mitogenome, la mitogenomes din cele două adâncime țipari lacomi prezintă un identice gene ordine (fig. 2)., Cu toate acestea, ordinea genei mitocondriale a celor două anghile gulper diferă foarte mult de cea a tuturor celorlalte vertebrate cunoscute până în prezent. Când unele gene Tarn au fost excluse din comparații (fig. 2), am identificat cinci gene blocuri (A, tRNAGlu–tRNAGln; B, ATP8-ND3; C, tRNALeu(CUN)–ND6; D, tRNAIle–tRNALys; și E, tRNAArg–tRNASer(AGY) gene regiuni), gena pentru care este identic cu cel de tipic vertebrate.,

Filogenetic Poziții de Doi Țipari lacomi

Figura 3 este de 50% regula majorității consens copac de 17,602 combinate probe de la două independente Bayesian analizele a 59 de secvențe de nucleotide mitocondriale de la concatenate 12 proteine-codare (nu 3 codonul poziții), plus 21 de gene arnt (stem regiuni numai) folosind GTR + I + Γ model de secvență de evoluție (Yang 1994). Cu excepția câtorva noduri din cadrul Neoteleostei, majoritatea ramurilor interne au fost susținute de probabilități posterioare Bayesiene înalte (≥95%)., Trebuie remarcat faptul că arborele rezultat demonstrează în mod explicit nu numai că cele două anghile gulper formează o relație soră-grup cu o probabilitate posterioară ridicată (100%), dar și că sunt adânc imbricate în Anguilliformes (anghile adevărate), sugerând cu tărie că au fost derivate dintr-un strămoș asemănător anghilei.recent, au fost determinate mai mult de 140 de secvențe mtDNA complete din peștii actinopterigieni (de exemplu, Miya și Nishida 1999, 2000; Inoue et al., 2000, 2001a, 2001b, 2001c, 2001d, 2003; Ishiguro, Miya și Nishida 2001, 2003; Kawaguchi, Miya și Nishida 2001; Miya, Kawaguchi și Nishida 2001; Miya și colab. 2003; Saitoh și colab. 2003) și au fost raportate câteva exemple de rearanjări genetice (fig. 1). Trebuie remarcat faptul că astfel de evenimente de rearanjare a genelor implică puține gene și că aranjamentul genetic al mitogenomilor gulper eel diferă foarte mult de cel al altor vertebrate.,pentru a deduce evoluția aranjamentelor genice în cele două anghile gulper, este necesară inferența pentru organizarea ancestrală bazată pe un cadru filogenetic fiabil. Deși țipari lacomi au fost incluse în Elopomorpha bazează exclusiv pe o distincte pelagice formă de larvă, numit leptocephalus, nimeni nu a confirmat lor filogenetice poziție cu ajutorul caracter matricelor derivate din morfologice sau date moleculare (Inoue și Miya 2001).,analiza Bayesiană folosind datele mitogenomice de la 59 de specii care reprezintă în totalitate diversitatea peștilor teleosteni (fig. 3) nu numai că a confirmat că noua ordine de gene a celor două anghile gulper își are originea într-un strămoș comun al celor două specii, dar a demonstrat, de asemenea, că originea lor era independentă de cele ale celorlalte ordine de gene noi. De asemenea, se pare că romanul gene pentru a Conger myriaster, un alt membru al Elopomorpha, are o origine independentă de cea a țipari lacomi., Trebuie remarcat faptul că Anguilla japonica, care are ordinea genei vertebrate tipice, a fost plasată cu încredere ca o specie soră a celor două anghile gulper. Reconstrucția cea mai parsimonioasă a evenimentelor de rearanjare a genei pe arborele filogenetic a indicat că ordinea genică aberantă a celor două anghile gulper este derivată din cea a vertebratelor tipice.

Mecanism Posibil pentru Gena Rearanjare în Țipari lacomi

Două mari mecanisme au fost propuse pentru a explica ale genei în vertebrate mitogenomes (Lee și Kocher 1995; Kumazawa et al. 1996)., Unul este tandem duplicarea genei regiuni ca urmare a alunecat strand mispairing, urmată de eliminări de gene (Moritz și Brown, 1986; Levinson și Gutman 1987). Deși dinamica aranjamentelor genei mitocondriale nu au fost explicate în unele nevertebrate (de exemplu, Kurabayashi and Ueshima 2000; Machida et al. 2002; Tomita și colab. 2002), vertebrate mitocondriale ale genei poate fi explicat printr-un astfel de mecanism (Desjardins și Morais 1990; Quinn și Wilson, 1993; Kumazawa și Nishida 1995; Kumazawa et al., 1996; Mindell, Sorenson, and Dimcheff 1998; Miya and Nishida 1999; Inoue et al. 2001b), iar fezabilitatea sa este susținută și de duplicările polimorfe frecvente ale secvențelor mtDNA (de exemplu, Stanton et al. 1994; Gach și Brown 1997; Mindell, Sorenson și Dimcheff 1998; Miya și Nishida 1999). Celelalte mecanisme sugerate invocă amorsarea ilicită a replicării de către tRNAs și integrarea rezultantă a genelor Tarn în jurul regiunii de control (Cantatore et al. 1987; Jacobs și colab. 1989).,deși al doilea model nu este exclus în acest moment, primul model este favorizat ca mecanism de rearanjare a genelor în mitogenomii gulper anghilă. Presupunând că un fragment de ADN lung în regiunea tRNAIle–CR a organizației tipice este duplicat (fig. 4), ștergerile ulterioare ale genelor redundante ar da naștere organizării genetice rearanjate în anghilele gulper. O astfel de duplicare în tandem și ștergeri ulterioare au dus cel mai mult la ordinea genelor observate și la distanțierele intergenice asociate în aceste două anghile gulper.,ștergerile multiple ale genelor redundante păreau incomplete în cele două anghile gulper, datorită mai multor întinderi de secvențe noncodante (fig. 2) care apar în jurul genelor implicate în rearanjare (fig. 4). Deși nc1 și nc2 în E. pelecanoides și nc, în S. lavenbergi sunt compuse din repetitive pseudogene corespunzătoare pentru a degenerat copii adiacente gene arnt, CR1 și CR2 în S. lavenbergi mitogenome identice secvențe de peste 800 bp, și CR1 este situat la prezumtiv duplicat poziție în timp ce CR2 este situat la poziția inițială a regiunii de control., Această observație în S. lavenbergi mitogenome sprijină conceptul de tandem duplicarea și ștergerea ulterioară evenimente ca având loc în tRNAIle–CR regiune (fig. 4).

Dacă patru din cinci gene contigue blocuri au fost dublate împreună într-un strămoș comun al celor două specii, și dacă ștergerea ulterioară de gene au avut loc înainte de speciație, asumate duplicat porțiuni de țipari lacomi, variind de la tRNAIle gene la CR tipic de organizație, au fost extinderea dincolo de 12 kb (fig. 1)., Înainte de acest studiu, regiunile presupuse duplicate ale rearanjării vertebrate cunoscute au fost cel mult 4 kb. Mai mult decât atât, toate cunoscute tandemly repetă secvențe de codificare s-au limitat la regiunile adiacente CR, IQM, sau WANCY regiuni, reflectând probabil ocazional imprecise încetarea de replici dincolo de originile lor. Regiunea duplicată din mitogenomul anghilei gulper a fost mult mai mare decât cea a rearanjamentelor vertebrate cunoscute vreodată și a implicat aproape întregul mitogenom (fig. 1).