Frontiere în Microbiologie

Introducere

Bacillus thuringiensis și alte 7 specii de formare de spori de bacteriile Gram pozitive, inclusiv B. cereus, B. cytotoxicus, B. anthracis, B. pseudomycoides, B. weihenstephanensis, B. toyonensis, și B. mycoidesare, sunt în primul rând detectat în sol. Deoarece aceste bacterii sunt foarte asemănătoare în genotip și fenotip, bacteriile sunt clasificate ca Grupul B. cereus în taxonomie (Park et al., 2007). B., cereus și B. thuringiensis sunt foarte detectabile în alimente, deoarece sunt observate în materiile prime din solul agricol în timpul cultivării și distribuției. În plus, aceste două bacterii nu sunt de obicei discriminate în diagnosticul clinic. B. cereus este un al doilea grup prioritar de risc al bolilor alimentare în produsele agricole proaspete, iar contaminarea sa este una dintre problemele majore ale legumelor (Felício et al., 2015). În special, B., thuringiensis a fost utilizat ca pesticid în cultivarea anumitor culturi și este bine cunoscut sub numele de insecticide microbiene care au fost utilizate pentru a reduce cantitatea de pesticide chimice (Azmi et al., 2015).B. thuringiensis produce proteine insecticide, care sunt principalul tip de proteine cristaline (Cry) (Kutasi și colab., 2016). În schimb, creșterea activă a celulelor vegetative care nu au producție de cristal duce la efecte netoxice. Endotoxinele δ conțin în principal citolitic (Cyt) și Cry (Elleuch et al., 2015; Rao și colab., 2015)., Cu toate acestea, Cyt și Plâng posedă o secvență diferită homologies chiar dacă ele constau în moduri similare de acțiune spre liza celulară, ceea ce duce la deteriorarea permanentă a insectelor midgut (Adang et al., 2014).

structurale variație de patru δ-endotoxine (Cry1, Cry2, Cry3, și Cyt2Ah) a fost observată prin cristalografia cu raze X (Dehury et al., 2013). Aceste gene sunt identificate în bumbacul transgenic și în alte legume, care sunt considerabil eficiente în combaterea dăunătorilor., Proiectarea unui biomarker pentru produsul Tradus variază în funcție de diferitele categorii de proteine cry; prin urmare, detectarea va fi complexă. Secvențele genei ARNr 16S bazate pe primeri universali au arătat un indice de similitudine mare (>99%) între B. cereus și B. thuringiensis (Böhm et al., 2015), care nu pot fi clasificate folosind teste genetice și fenotipice (Peng et al., 2015). În plus, a existat o discuție încă din 2000 cu privire la faptul dacă întregul grup B. cereus ar trebui tratat ca o specie complexă de bacterii diverse (Helgason et al.,, 2000; Bartoszewicz și Marjańska, 2017). Există, de asemenea, sugestii care filogenie de aceste bacterii se potrivește mai bine la lor proprietăți ecologice (psychrotolerance, virulența) decât să-apartenența taxonomică (Drewnowska și Swiecicka, 2013; Bartoszewicz și Marjańska, 2017). Pentru a rezolva această problemă, am vizat XRE pentru a detecta B. thuringiensis, care controlează tipul major de producție de proteine cristaline.aceste două bacterii sunt foarte asemănătoare în rezultatele biochimice (Böhm et al., 2015) și proprietăți genetice (Osman și colab., 2015). Cho și colab., (2015) a raportat, de asemenea, că proprietățile genetice și fenotipice dintre aceste bacterii sunt abia distinse. Mai mult, Pfrunder și colab. a raportat că speciile din grupul B. cereus nu pot fi identificate în mod fiabil folosind biotiparea clasică (Pfrunder et al., 2016). Pe baza acestora, experimentele biochimice ar putea să nu fie suficiente pentru diferențiere. În schimb, prezența unei proteine cristaline insecticide a fost utilizată ca o caracteristică distinctă pentru a diferenția aceste bacterii (Ekino et al., 2014; Wei și colab., 2018).,unii dintre factorii care diferențiază aceste două bacterii se bazează pe patogenitatea lor în probe. B. cereus provoacă tulburări gastro-intestinale, în timp ce B. thuringiensis a fost, de asemenea, implicat în epidemii de diaree. După cum sa raportat, caracteristica distinctivă a lui B. thuringiensis este prezența proteinelor cristaline insecticide (δ-endotoxină) criptate de genele cry (Osman et al., 2015; Albright și colab., 2016). Deoarece metoda de identificare folosind biomarker pentru diferențierea B., grupul cereus este complex și consumator de timp, este nevoie urgentă de un biomarker extrem de eficient pentru a le înlocui pe cele anterioare care au dat o eficiență mai mică și uneori chiar au prezentat rezultate false. Pe baza celor două gene specifice, regulatorul transcripțional și genele proteinei cristaline pentru B. thuringiensis (Porcar și Juárez-Pérez, 2003; Han și colab., 2006), actualul studiu a fost efectuat pentru a inspecta și de a compara eficiența conceput biomarker (PUȚIN) pentru că de cele existente cristal proteina (cry2) în identificarea B. thuringiensis de B. cereus grup de tulpini (Bcg) și non-B., tulpinile cereus group (non-B) în produsele alimentare. cry2este cea mai comună proteină cristalină prezentă în B. thuringiensis (Liang et al., 2011; Palma și colab., 2014).

materiale și metode

prepararea culturilor de bacterii

toate cele 120 de tulpini, inclusiv 111 de Bcg și 9 non-B, au fost obținute din colecții bacteriene din Statele Unite și Coreea de Sud (tabelul suplimentar 1). Printre colecții, B. thuringiensis ATCC 10792 (tulpina de tip) a fost utilizat pentru optimizarea condițiilor experimentale ale PCR convenționale și PCR în timp real., Toate tulpinile au fost dezghețate la temperatura camerei (25°C) și strecurate pe agarul nutritiv (Difco, MI, Statele Unite). După cultura de 24 h la 35°C în incubator, o colonie pură a fost ales și inoculate în tryptic soy bulion (Difco, MI, Statele Unite ale americii) și peste noapte culturi au fost folosite pentru experimente ulterioare.

proiectarea primerului și izolarea ADN

primerii respectivi care vizează XRE pentru diferențierea B., thuringiensis (Tabelul 1) au fost concepute în conformitate cu următoarea secvență din Bacillus thuringiensis ATCC 10792 (Gene – 3664610-3665047) folosind Primer Express® Software (Versiunea 3.0.1) de applied Biosystems situat în CA, Statele Unite ale americii și sintetizate de Bioneer Corporation din Daejeon, Coreea de sud. Performanța XRE proiectată a fost comparată cu cry2 (Ben-Dov et al., 1997). După 24 de ore de îmbogățire în TSB, o alicotă de 1 mL de bacterii a fost supusă extragerii ADN-ului genomic utilizând reactivul PrepMan ® Ultra Sample Preparation (Applied Biosystems, CA, United States)., Concentrațiile ADN au fost măsurate prin fluorescența Eppendorf BioSpectrometer® (Eppendorf, Hamburg, Germania) și ajustate la 10 ng/µL. Probele de ADN au fost păstrate la -20°C înainte de utilizare.

Convenționale PCR și Real-Time PCR

convenționale PCR au fost pregătite cu o C1000 TouchTM Thermal Cycler de Bio-Rad situat în Hemel Hempstead, Marea Britanie., Tubul de reacție pentru PCR utilizat Accu-Power ® Pyro Hot Start Taq PCR pre-Mix de la Bioneer Corporation situat în Daejeon, Coreea și un volum de 20 µL, inclusiv 1 µL din fiecare primer (10 pmoL/µL) și 2 µL de ADN. Amplificare condiții convenționale PCR pentru transcripțional de reglementare (PUȚIN) au fost: denaturare inițială la 95°C timp de 5 min, urmată de 35 de cicluri de denaturare la 95°C timp de 30 s, recoacere la 49°C timp de 30 s și alungirea la 72°C timp de 30 s, și o elongarea finală la 72°C timp de 5 min., Amplificări condiții de cristal proteine (Cry 2) au fost: denaturare inițială la 95°C timp de 5 min, urmată de 35 de cicluri de denaturare la 95°C timp de 30 s, recoacere la 55°C timp de 30 s și alungirea la 72°C timp de 1 min, si o elongarea finală la 72°C timp de 5 min. După amplificări ADN, soluție de gel de agaroză 1.5% (g/V) care conține soluție de acid Nucleic RedsafeTM 20,000 × (Intron Biotechnology, Inc.) a fost preparat și electroforeza în gel a fost efectuată utilizând modelul subcelular 192 de la Bio-Rad situat în Hemel Hempstead, Marea Britanie., Benzile au fost vizualizate folosind Smart View Pro Uvci-1100 Imager system De La Major Science situat în CA, Statele Unite ale Americii. Precizia (AC) a fost utilizat pentru a evalua metoda PCR utilizând primeri PUȚIN și cry2 în detectarea B. thuringiensis de Bcg și non-B. Negativ acord (NA) înseamnă același rezultat negativ pentru non-B. thuringiensis folosind PCR cu PUȚIN și cry2. Acordul pozitiv (PA) înseamnă același rezultat pozitiv pentru B. thuringiensis folosind PCR cu XRE și cry2. Precizia (AC) este măsurată folosind următoarea ecuație, AC = ×100% (Ma și colab., 2014).,experimentele PCR în timp real au fost efectuate de sistemul PCR în timp real StepOneTM de la Applied Biosystems situat în CA, Statele Unite ale Americii. Un volum de reacție de 20 µL format din 10 µL de Melt DoctorTM high Resolution Melting (HRM) Master Mix, 2 µL de ADN, 0,5 µL de primer F/R (10 pmoL/µL) (Tabelul 2). Condițiile de amplificare ale qPCR au fost: denaturarea inițială la 95°C timp de 10 minute și 40 de cicluri la 95°C timp de 15 s și 60°C timp de 1 min. Apoi, în analiza ulterioară a curbei de topire, temperatura a fost setată să crească de la 60 la 95°C la 0,3°C/ciclu pentru a testa specificitatea grundului.,

Evaluarea de Real-Time PCR

performanța de PUȚIN și cry2 a fost evaluată cu ajutorul a 50 de B. thuringiensis tulpini, în timp ce exclusivitatea a fost testat cu ajutorul 70 de non-țintă bacterii, inclusiv 58 B. cereus (Bc), 3 Bcg, și 9 non-B (Chelliah et al., 2017). O curbă standard a fost făcută folosind diluții de 10 ori ale ADN-ului extras din B. thuringiensis ATCC 10792., Concentrațiile ADN au fost ajustate de la 10 ng/µL la 100 fg/µL, corespunzând la 2,6 × 106 la 2,6 × 10 CFU, iar amplificările au fost efectuate prin PCR în timp real cu triplate. Pentru controalele negative, a fost utilizată apă distilată. Rezultatele Negative sau absența curbelor de amplificare au fost luate în considerare atunci când valorile pragului ciclului (Ct) au fost mai mari de 40.

Detectarea B. thuringiensis în Țepi Probe de Alimente,

Salata verde (Lactucasativa), Kimbab, și spanac (Spinaciaoleracea) au fost cumpărate de la o piață locală în Chuncheon, Coreea de sud., Probele au fost testate pentru absența bacteriilor țintă în conformitate cu ISO 7932 (2004). O alicotă de 50 g din fiecare fel de mâncare a fost preparată într-o pungă sterilă de stomacher de la Nasco Whirl-Pak, situată în WI, Statele Unite. Culturile Overnight B. thuringiensis au fost diluate în apă peptonă 0.5% și utilizate pentru prepararea probelor contaminate artificial cu niveluri de inoculare de la 103 la 105 CFU / g (Chon et al ., 2012; Kim și colab., 2013). O alicotă de 1 mL din suspensia probelor de alimente a fost transferată într-un nou tub sterilizat și utilizată pentru extracția ADN-ului.,

Rezultate și Discuții

Detectarea de B. thuringiensis, Folosind cry2 Gene

Pentru 120 de tulpini, produse de amplificare de aproximativ 700 bp au fost obținute folosind primeri cry2 (Tabelul 1). După cum se arată în tabelul 2 și Figura 1, atunci când se utilizează PCR direcționarea cry2, 6 tulpini B. cereus și 36 tulpini B. thuringiensis (72%) au fost amplificate. Niciun alt grup B. cereus sau grup non-B nu a fost amplificat. Aceasta a arătat o precizie de 82% din cry2 pentru detectarea grupurilor B. cereus. Pentru cele 120 de tulpini testate, 100 de tulpini au dat NAs sau PAs, indicând un procent global de precizie de 83.,3% (Tabelul Suplimentar 1). În timp ce Riojas și colab. (2015) a raportat un multiplex PCR de non-ribozomal peptide sintetazei (PNR) gene și cry1 pentru a identifica B. cereus și B. thuringiensis cu o specificitate de 24,5% în B. cereus și 15% în B. thuringiensis.

detectarea probelor de alimente cu vârf

recent, s-a raportat că B. thuringiensis a fost detectată în alimente precum laptele, fructele proaspete și boabele care au fost cultivate și recoltate din sol în afara țării., Consumul de legume crude și minim procesate este considerat natural și sănătos, dar au fost ridicate îngrijorări cu privire la pesticidele chimice reziduale din legumele proaspete (Chiu et al., 2016). Astfel, consumatorii și-au îndreptat interesul către legumele organice (legume fără substanțe chimice) și se preconizează că bio-pesticidele, inclusiv B. thuringiensis, pot reprezenta 20% din piața mondială a pesticidelor până în 2020 ca înlocuitor al pesticidelor chimice (Watts și Williamson, 2015)., În acest studiu, performanța PCR în timp real de direcționare XRE a fost evaluată cu 3 tipuri de probe de alimente contaminate artificial (salată, Kimbap și spanac). Culturi proaspete peste noapte de B. thuringiensis au fost inoculate în fiecare probă de alimente. PCR în timp real a putut detecta cu succes B. thuringiensis la o concentrație de 4, 8 × 103, 3, 4 × 103 și 1, 5 × 103 CFU/g în salată, kimbap și, respectiv, spanac (Figura 3). Cu toate acestea, pentru probele kimbap, valorile Ct au fost mai mari, deoarece de obicei conține materiale mai complexe, cum ar fi cârnați, ouă sau morcov, comparativ cu legumele.,figura 3

concluzie

deoarece grupul B. cereus este foarte similar în profilurile biochimice, precum și genetice, a fost dezvoltat un nou biomarker pentru identificarea și distingerea lui B. thuringiensis de grupul strâns legat. Performanța XRE a fost comparată cu gena cry2 și au fost testate și probe contaminate artificial. În comparație cu cry2, s-a observat că gena XRE este eficientă în identificarea B. thuringiensis. Mai mult, PCR-ul dezvoltat în timp real folosind XRE a identificat cu succes B., thuringiensis și ar putea fi utilizate pentru a cuantifica numerele de celule cu curba standard generată.această lucrare de cercetare a fost susținută de Ministerul Agriculturii, Alimentației și siguranței medicamentelor (Grant Nr.14162mfds085) din Republica Coreea și Universitatea Națională Kangwon în 2015. SW a fost recunoscător pentru sprijinul financiar din partea Consiliului Bursei din China (CSC No: 201408260054). Autorii ar dori să-i mulțumească lui Hyun-Ah Lee la laboratorul Central al Universității Naționale Kangwon pentru suportul tehnic., RC este recunoscător pentru sprijinul financiar din partea Fundației Naționale de cercetare din Coreea (NRF) 2018007551.

Declarație privind conflictul de interese

autorii declară că cercetarea a fost efectuată în absența oricăror relații comerciale sau financiare care ar putea fi interpretate ca un potențial conflict de interese.

Materiale Suplimentare