proteinele membranare integrale
proteinele membranare integrale (IMPs) acționează ca gateway-uri către celule. Toate celulele și organele sunt învelite într-un strat lipidic impermeabil, iar IMPs-urile pe care le studiem sunt încorporate în aceste membrane. Acestea sunt căile de intrare și ieșire pentru mulți ioni, nutrienți, deșeuri, hormoni, medicamente și molecule mari, cum ar fi proteinele și ADN-ul. Ele sunt, de asemenea, responsabile pentru o mare parte din comunicarea dintre celule și mediul lor., Celulele pot produce o mare varietate din aceste proteine, aproximativ 30% din genele din genomul uman codifică proteinele membranare, și totuși știm relativ puțin despre aceste molecule.proteinele membranare sunt, din păcate, notorii dificil de manevrat și de studiat, deoarece sunt proiectate să stea în mediul hidrofob al bistratului lipidic. Ele tind să fie instabile atunci când sunt extrase din mediul lor nativ și trebuie să adăugăm detergenți pentru a acoperi suprafața hidrofobă., Pentru a înțelege și controla funcția acestor proteine, este esențial să existe informații despre structura lor tridimensională, care se obține de obicei prin cristalografia cu raze X. Cu toate acestea, dificultatea manipulării acestor proteine a făcut dificilă rezolvarea structurilor și până în prezent există mai puțin de 300 de structuri de proteine membranare cunoscute, mai puțin de 0,5% din toate structurile cunoscute. Pentru eucariotele superioare povestea este și mai clară, cu doar 20 de structuri de IMPs umani și mai puțin de 50 de IMPs mamifere rezolvate., Proteinele membranare sunt, prin urmare, una dintre cele mai importante frontiere rămase ale cercetării biologiei structurale. La SGC aplicăm acum metodele noastre de ultimă generație pentru a depăși blocajele din cercetarea proteinelor membranare, astfel încât să putem livra în mod fiabil probe de proteine membranare pure și structuri ale acestor molecule fascinante și critice din punct de vedere medical.importanța medicală a acestei familii enorme de proteine nu poate fi supraestimată., Mutațiile proteinelor membranare sunt implicate în multe boli comune, inclusiv boli de inimă, unde sunt adesea implicate canale ionice care funcționează defectuos. Medicamentele orientate către canalele de calciu pot controla probleme precum hipertensiunea arterială și angina pectorală. Proteinele membranare sunt implicate în cancer, unde erorile în căile de semnalizare pot duce la separarea celulelor de sub control. Adesea, proteinele membranare specifice sunt supraproduse în celulele canceroase și, prin urmare, sunt ținte pentru terapia medicamentoasă. Boli ale creierului, cum ar fi migrena, depresia și Alzheimer sunt toate legate de probleme cu transportatorii și canalele., Fibroza chistică este cauzată de mutații ale genei regulatorului conductanței transmembranare a fibrozei chistice (CFTR) care codifică un canal de ioni de clorură.deoarece multe proteine membranare stau la suprafața celulelor, ele sunt ușor disponibile pentru medicamentele cu molecule mici care circulă în sânge. Prin urmare, nu este surprinzător faptul că peste 50% din medicamentele cu molecule mici se leagă de proteinele membranei. Receptorii și canalele cuplate cu proteina G sunt deosebit de importante în acest sens, dar transportatorii ABC și transportatorii soluți sunt, de asemenea, ținte pentru terapia medicamentoasă., Înțelegerea noastră de multe alte boli, și capacitatea noastră de a trata aceste boli ar beneficia foarte mult de mai multe informații structurale și funcționale pe proteine implicate. Sperăm că prin rezolvarea structurilor acestor proteine, înțelegerea biochimiei care stau la baza și interacțiunile cu substraturile și inhibitorii, putem oferi tratamente mai eficiente pentru multe boli.SGC are o vastă experiență în rezolvarea structurilor de proteine umane solubile folosind sisteme de înaltă eficiență, cu debit mare., În ultimii doi ani am adaptat aceste metode pentru rezolvarea structurilor pentru proteinele membranare umane. Am analizat 186 de proteine membranare umane din diverse familii, selectând o serie de construcții pentru fiecare proteină, identificând detergenții adecvați pentru purificare și apoi scalând purificaitonul și cristalizând aceste proteine. Am cristalizat 3 proteine membranare și am rezolvat prima noastră structură, proces care a durat mai puțin de doi ani de la prima clonă la structură.,am rezolvat prima structură a unui transportor ABC uman, o clasă de proteine care sunt implicate în transportul moleculelor mici, rezistența la mai multe medicamente și boli precum fibroza chistică și diabetul. Prima noastră țintă de succes este transportorul ABC mitocondrial uman, ABCB10, care este încorporat în membrana interioară a mitocondriilor. ABCB10 este supraexprimat în timpul diferențierii eritroide, procesul care formează globule roșii. este supraexprimat în măduva osoasă, inimă și ficat., Există acum dovezi că, atunci când ABCB10 expresie este redusă în celule, ele sunt mult mai sensibile la stres oxidativ și că ABCB10 pot fi implicate în protejarea inimii în timpul unui atac de cord. tehnologii pentru studierea IMPs dezvoltăm metode generice care permit determinarea înaltă a structurilor proteinelor membranare umane. Am selectat sistemul de exprimare a celulelor baculovirus/insect, care oferă o compoziție lipidică apropiată de cea a celulelor umane și este o platformă dovedită cu un randament ridicat., Pentru fiecare proteină țintă generăm o serie de construcții de diferite lungimi și diferite etichete de afinitate, inclusiv gena de lungime completă și o serie de trunchiuri pentru a elimina regiunile potențial dezordonate. Un ecran de Expresie cu debit mare este utilizat pentru a identifica proteinele care pot fi utilizate pentru a purifica cantitățile de miligram de IMPS pentru cristalizare. Fiecare proteină este inițial purificată în detergent dodecil maltozid (DDM) și este ulterior cernută pentru stabilitate într-o serie de detergenți diferiți pentru a identifica condițiile optime pentru stabilitate și cristalizare.,
am stabilit metode de cristalizare nanodrop de mare debit și manipulare a cristalelor de proteine membranare fragile. Am dezvoltat sisteme eficiente pentru screening-ul cristalelor proteice membranare pentru calitatea difracției ca metodă de optimizare a conditonului de cristalizare. De asemenea, am optimizat colectarea datelor și analiza datelor de difracție folosind linii de fascicul sincrotron microfocus intense, disponibile la resurse precum Diamond Light Source Ltd, în Oxfordshire., Ori de câte ori este posibil, cristalizarea se realizează cu liganzi legați și inhibitori pentru a capta o singură Conformație nativă și pentru a oferi informații cheie despre funcția și designul medicamentului. De asemenea, intenționăm să generăm fragmente de anticorpi împotriva proteinelor noastre purificate pentru a fi utilizate ca reactivi de afinitate și ajutoare de cristalizare.
Lasă un răspuns