antikroppar är immunoglobulin (ig) glykoproteiner som produceras av plasmaceller (B-celler) som svar på främmande antigena molekyler (immunogener). Den primära funktionen av antikroppar är att binda specifikt till dessa främmande antigener för att inaktivera dem och / eller markera dem för destruktion av immunsystemet, vilket skyddar värden från infektion. Det finns flera klasser av antikroppar., Den första delen av denna sammanfattning fokuserar på konventionella fullstor antikroppar, IgG-och IgM-klassantikropparna, som används kraftigt i en mängd forskning, diagnostiska och terapeutiska biomedicinska applikationer.
den grundläggande enheten för en konventionell antikropp är en fyra polypeptid enhet bestående av två identiska tunga kedjor och två identiska lätta kedjor som hålls samman av disulfidbindningar. De lätta kedjorna är kortare, med lägre molekylvikter än de tunga kedjorna., Den allmänna formen av en antikropp är en Y, med ett flexibelt gångjärn (interdomain) region i mitten av Y. flexibiliteten i interdomain gångjärn regionen är viktigt för bivalent bindning av en antikropp, vilket gör att de två bindande fickor för att interagera med antigena platser på varierande avstånd. Varje polypeptidkedja har en konstant region, som inte varierar signifikant bland antikroppar och en variabel region, som är specifik för varje enskild antikropp. Den gemensamma notationen för ljuskedjans variabla region är VL och för ljuskedjans konstanta region är CL (Figur 1)., Notationen liknar den tunga kedjevariabeln (VH) och konstanta regioner (CH) med CH1, CH2 och CH3 som betecknar de olika konstanta regiondomänerna i den tunga kedjan. Kolhydrater är normalt kopplade till CH2-domänerna i de tunga kedjorna. Fragmentet kristalliserbara (Fc) regionen innehåller endast konstanta områden från de tunga kedjorna (CH), men fragmentet antigenbindande regionen (Fab) innehåller både en konstant domän och de variabla domänerna för både tunga och lätta kedjor (VH och CL). Fragmentvariabelregionen FV-regionen innehåller endast de två variabeldomänerna (Figur 1)., Se musantikropp för diskussion om immunoglobulin-isotyper, underklasser och antalet immunoglobulindomäner.
varje komplett antikropp har två antigenbindande fickor, belägna i FV-regionerna, och kan binda till två antigener (bivalent bindning)., Om de två antigenerna är för nära (≤3 nm), eller för långt ifrån varandra (≥29 nm), kan antikroppen endast binda till ett antigen (monovalent bindning) . Det finns en signifikant affinitetsförändring mellan monovalenta och bivalenta bindningar med en 1,500-faldig förändring i KD-värden .
strukturen hos specifika antikroppar är tillgänglig från den strukturella Antikroppsdatabasen (SAbDab), en kurerad databas med offentligt tillgängliga antikroppsstrukturer, samt strukturella modelleringsverktyg, som uppdateras varje vecka från Protein Data Bank (PDB) .,
konventionella fullstorsantikroppar har använts i forskning för proteindetektering via västerländska blotanalyser , immunhistokemi och enzymbundna immunosorbentanalyser (ELISA) i årtionden. Full storlek antikroppar har också utvecklats för diagnostiska tillämpningar såsom graviditetstest och detektion av bakterier och virus i blod, såsom en ELISA som detekterar HIV. Dessutom används konventionella fullstor antikroppar vanligen i sjukdomsterapeutics., Infliximab är till exempel en antikropp av många tillgängliga som känner igen tumörnekrosfaktor alfa (TNFa) och det används vid behandling av Crohns sjukdom och reumatoid artrit . Trastuzumab eller Herceptin är en antikropp som binder till epidermal tillväxtfaktorreceptor 2 och används vid behandling av metastaserad bröstcancer . Det finns också flera antikroppsbaserade terapier, inklusive Muromonab, som ges till transplantationspatienter för att förhindra allograftavstötning.,
även om konventionella fullstor antikroppar både kan användas för terapeutiska tillämpningar, finns det fördelar och nackdelar med att använda den fullständiga antikroppen. En viktig fördel med konventionella antikroppar är det faktum att Fc-regionen engagerar kroppens immunsvar och kan rikta in bundna antigener för destruktion. Denna Fc-region kan också vara en nackdel i vissa kliniska applikationer eftersom immunsvaret som det vanligtvis framkallar kan vara skadligt för patientens hälsa., Dessutom kan antikroppar i full storlek inte tränga in i vissa vävnader på grund av deras relativt stora storlek . I vissa fall kan Fc-domänen vid användning av fullstorleksantikroppar för diagnostiska tillämpningar orsaka betydande icke-specifik bindning, vilket kan försämra detekteringsapplikationer.
För många tillämpningar är antikroppsfragment att föredra. Antikroppsfragment kan produceras genom kemiska eller genetiska mekanismer., Kemisk fragmentering använder reduktionsmedel för att bryta disulfidbindningarna inom gångjärnsområdet och uppslutning av antikroppen med proteaser inklusive pepsin, papain och ficin. Genetisk konstruktion av fragment erbjuder förmågan att skapa en mängd fragmentinnehållande molekyler, var och en med unika bindande och funktionella egenskaper.
kemisk och proteasförtunning av IgG-eller IgM-antikroppar i full storlek ger antigenbindande fragment (Fab; Figur 1) och Fc-fragment, som endast består av de tunga kedjorna CH2 och CH3., Biokemiska metoder för att generera antikroppsfragment producerar användbara verktyg för diagnostiska och terapeutiska tillämpningar, men det är ganska mödosamt och kräver en stor mängd antikroppsstartmaterial.
de antigenbindande fragmenten som produceras genom biokemisk digestion inkluderar Fab, (Fab’)2, Fab’ och FV, som alla saknar Fc-regionen. Monovalenta f (ab) – fragment har ett antigenbindningsställe, medan divalenta (Fab’)2-fragment har två antigenbindande regioner som är kopplade till disulfidbindningar., Två individuella f (ab) fragment produceras när en fullstor antikropp smälts med papain enzym. Ett f (ab’)2-fragment, som behåller en del av gångjärnsområdet, produceras genom pepsinförtunning av IgG-eller IgM-antikroppar. Reduktion av f (ab’)2 fragment producerar 2 monovalenta fab’ fragment, som har en fri sulfhydrylgrupp som är användbar för konjugering till andra molekyler. FV-fragment är det minsta fragmentet tillverkat av enzymatisk klyvning av IgG-och IgM-klassantikroppar (Figur 1)., FV-fragment har antigenbindningsstället i VH-och VL-regionerna, men de saknar de konstanta regionerna i Fab (CH1 och CL) – regionerna (Figur 1, höger panel). VH och VL hålls samman i FV-fragment genom icke-kovalenta interaktioner. Fragmenten kan genereras genom kommersiellt tillgängliga kit, till exempel f (ab’)2 Fragmenteringssats från G-Biosciences .,
Genteknikmetoder gör det möjligt att producera enkla kedjevariabla fragment (scFv), vilka är fragment av FV-typ som består av VH-och VL-domänerna kopplade med en konstruerad flexibel linkerpeptid (Figur 1) . Manipulation av orienteringen av V-domänerna och linkerlängden skapar olika former av FV-molekyler . När länkaren är minst 12 resthalter lång är scfv-fragmenten huvudsakligen monomeriska (som visas i Figur 1) ., Linkers som är 3-11 rester lång avkastning scFv molekyler som inte kan vikas in i en funktionell FV domän. Dessa molekyler associerar med en andra scFv-molekyl, vilket skapar en bivalent diabody . Om linkerlängden är mindre än tre rester, associerar scFv-molekyler till triabodier eller tetrabodier . Till exempel, Tao Y et al genereras en VH-VL diabody med en kort GGGGS länkare och scFv med en lång GTTAASGSSGGSSSGA linker ., Multivalenta scFvs har större funktionell bindningsaffinitet till deras målantigener som ett resultat av att ha ytterligare två mål antigenbindningsställen, vilket minskar off-raten av antikroppsfragmentet . Minibodies är scFv-CH3 fusionsproteiner som samlas i bivalenta dimers . Små scFv-fragment med två olika variabla domäner kan genereras för att producera bispecifika bis-scFv-fragment som kan binda två olika epitoper samtidigt . Genetiska metoder används också för att skapa bispecifika fab dimers (Fab2) och trispecific fab trimers (Fab3)., Dessa antikroppsfragment kan samtidigt binda 2 eller 3 olika antigener.
förutom konventionella antikroppar innehåller camelid och shark (squalidae) en delmängd av säregna tunga Kedjantikroppar (Hcab) uteslutande sammansatta av tunga kedjans homodimerer som saknar lätta kedjor . Fab-delarna av dessa antikroppar, som kallas VHH i kamelider och VNAR i hajar, är de minsta antigenbindande regionerna som naturligt finns., Nanobodies är VHH-rekombinant framställda domäner kan binda antigener, ofta klonade från VHH fag biblioteken såsom de mot betacoronarivus S proteiner . Deras bindande termodynamik och strukturer har studerats (och referens däri)., Nanokroppar är mycket stabila och kan lätt produceras i stor mängd genom att använda vanliga enkla proteinuttryck system som bakterier (funktionella konventionella fullstor antikroppar är svåra att uttrycka ordentligt i ett bakteriesystem), vilket representerar ett lovande verktyg för forskning och terapeutiska ändamål, särskilt inom områdena superupplösningsmikroskopi, masspektrometri och målinriktad proteinnedbrytning . Nanokroppar kan också levereras inuti levande celler genom konjugerade med peptider, eller in vivo, eller uttryckas direkt in vivo och känner igen sina mål in vivo., Nanobodies mot RFP eller GFP, när konjugerad med långt rött Atto färgämnen, nått 118-faldig förstoring av fluorescerande signaler över GFP eller RFP, och användes för att generera hela kroppen musen neurala anslutningar . De har också använts för att stabilisera det aktiva tillståndet av proteiner i strukturella studier . Ett uttryckssystem med flera sammankopplade nanokroppar mot olika influensastammar undersöks som ett sätt att generera ett universellt influensavaccin ., Rekombinanta Anti-IgG sekundära nanokroppar har stor potential att ersätta allmänt använda polyklonala sekundära antikroppar som produceras med djur .
Nanokroppar har den unika förmågan att korsa blod-hjärnbarriären; nanokroppar tenderar dock att behandlas och rensas mycket snabbt från kroppen . Nanobodies kan användas för metoder som immunoprecipitation, till exempel, RFP-Fällan MA från Chromotek , eller kopplas till fluorescerande proteiner för att spåra intracellulära mål i levande celler i real-tid .,
cirka 10% av bovint immunoglobuliner innehåller en ovanligt lång tredje tungkedjig komplementaritetsbestämmande region (CDR 3H) med ett stort antal cysteinrester . Dessa cysteiner par för att bilda disulfidbindningar vilket leder till en stjälk-och-knopp liknande struktur i antigenbindningsdomänen . Denna exceptionellt långa cdr3h-domän med långstången bidrar till mångfalden av bovin antikroppsspecificitet.,
Intrabodies, eller intracellulära antikroppar, hänvisar till antikroppar eller deras fragment (vanligtvis av scFv-design) uttryckta direkt inuti celler eller i djur in vivo genom en uttrycksvektor. Dong JX et al utvecklade till exempel flera nanokroppar mot neuronala proteiner för intracellulärt uttryck som intrabodier . En viktig faktor/varning är den reducerande intracellulära miljön som minskar affiniteten hos ett antikropps-eller antikroppsfragment vars bindning med antigenet är beroende av intradomändisulfidbindningar., Ett annat övervägande är att intrabodies tenderar att aggregera. Kabayama h et al utformade intrabodies med en netto engativ laddning även vid lägsta cytoplasmiska pH 6,6 för att generera ultrastabila cytoplasmatiska antikroppar . Intrabodies används som alternativ till farmakologiska hämmare för att rikta specifika endocytiska deltagare., Till exempel, uttryck för en single chain variable fragment (scFv) som härstammar från 3B12A monoklonal antikropp mot TDP-43 kärnteknisk export signal i HEK293A celler i livmodern eller efter electroporation av sin yttrandefrihet vektor främjat proteolys av TDP-43 aggregat i odlade celler och embryonala mus hjärnan ., Virusmedierad leverans i nervsystemet hos en scFv-antikropp mot RNA-igenkänningsmotivet 1 av TDP-43 minskad mikroglios i en musmodell av akut neuroinflammation och mildrad kognitiv försämring, motorfel, TDP-43 proteinopati och neuroinflammation hos transgena möss som uttrycker TDP-43 mutationer kopplade till amyotrofisk lateralskleros . Potentialen hos intrabodies som en terapeutisk modalitet återstår att dyka upp.
ett antikroppsfragment kan också kopplas till en cellimporttagg, till exempel en IPTD-tagg , för att underlätta dess inträde i celler.,
antikroppsfragment ger vissa fördelar jämfört med en fullstor antikropp för vissa tillämpningar. Detta ämne granskades av Nelson . En fördel med fragment över antikroppar i full storlek är att antikroppsfragment är mindre än konventionella antikroppar och i allmänhet saknar glykosylering, vilket möjliggör deras produktion i prokaryotiska uttryckssystem, vilket ger tid och kostnadsbesparingar., Dessutom är fragment tillräckligt små för att infiltrera i vissa vävnader som fullstora antikroppar inte kan tränga in, vilket hjälper till i många terapeutiska och immunhistokemiska förfaranden . Dessutom är bristen på Fc-domän en betydande fördel för primära antikroppar som används i immunohistokemi och andra detekteringsapplikationer eftersom de har minskat kraftigt icke-specifik bindning till Fc-receptorn. En scFv som vanligen används vid diagnostik är NC10-antikroppen mot influensauraminidas., Moc-31-antikroppen mot epitelcellens adhesionsmolekyl Ep-CAM är en scFv som vanligen används som cancerbehandling. Diabetiker, triabodier och tetrabodier har potentiella användningsområden i applikationer som radioimmunoterapi och diagnostisk in vivo-bildbehandling . Fragment som saknar Fc-domänen bryts emellertid ned i kroppen mycket snabbare än konventionella antikroppar och kan inte framkalla Fc-medierade cytotoxiska processer om de inte konjugeras till en effektordel , vilket kräver ytterligare optimering för antikroppsfragmentbaserade terapeutiker.,
även om olika antikroppsfragment erbjuder vissa fördelar, används de inte ofta i experiment. I mer än 60.000 artiklar manuellt curerad av Labome endast ett fåtal artiklar citerade tillämpningar av antikropp Fab fragment. Roche Anti-digoxigenin fab antikroppsfragment (11093274910) och anti-fluorescein fab antikroppsfragment ( 11426338910) genereras hos får och produceras genom matsmältning med papain. Anti-digoxigenin-fabfragment användes för in situ-hybridiseringar eftersom RNA-sonderna är märkta med digoxigenin ., De användes också för att utföra proteinfällningsanalys för att studera processen med en enda calmodulin-molekyl som viks genom enmolekylstyrka spektroskopi . F(ab) fragment av anti-mus sekundära antikroppar används ofta för att blockera endogena musen Ig under immunostaining, till exempel, AffiniPure Fab-fragment Donkey antimouse IgG från Biozol (JIM-715-007-003) .,
Invitrogen Alexa Fluor 546-konjugerad get anti-kanin IgG f(ab’)2 fragment användes för att utföra immunhistokemi för att undersöka rollen som sFLT-1 Vid upprätthållandet av det avaskulära fotoreceptorskiktet i musmodeller och Invitrogen Alexa Fluor 488 (Fab’)2 fragment av kanin anti-get IgG (H+L) användes i immunohistokemi för att undersöka mekanismen för tip link regenerering i hörselhårceller .,
Fc-receptorer (FCR) är molekyler uttryckta främst på/i medfödda immunceller, som känner igen och binder FC-domänen av antikroppar och därigenom initierar ett cellbaserat immunsvar. De olika funktionerna hos FCR återspeglar det breda utbudet av skyddande eller modulerande Roller av antikroppar, inklusive mediering av neutralisering och clearance av riktade substrat samt Programmering av adaptiv immunitet ., De biologiska funktionerna hos FCR regleras av immunoreceptor tyrosinbaserade aktiveringsmotiv (ITAMs) och immunoreceptor tyrosinbaserade hämmande motiv (ITIMs), som fungerar som receptorns gränssnitt med aktiverande och hämmande signalvägar, respektive. Således kan signalering av ITAMs framkalla cellaktivering, fagocytos och endocytos, medan signalering av ITIMs har en hämmande effekt på cellaktivering . FCR har beskrivits för alla klasser av immunoglobuliner och några av dem diskuteras nedan.,
denna familj innehåller fcyri, fcyrii, fcyriii och deras isoformer. De är ansvariga för antikroppsberoende cellmedierad cytotoxicitet (ADCC) och antikroppsberoende cellmedierad fagocytos (ACDP).
en annan receptor som binder IgG är neonatal Fc-receptor (FcRn), som är involverad i överföringen av passiv humoral immunitet från en mor till hennes foster. FcRn skyddar också IgG från nedbrytning in vivo och förklarar deras långa halveringstid i serumet ., Detta fenomen har lett till utvecklingen av bättre terapeutiska antikroppar genom att införa förändringar i Fc-regionen för att främja Fc-fcrn-interaktionen.
de inkluderar FceRI med hög affinitet, som kan binda monomerisk IgE och lectin fcerii med låg affinitet C-typ, som interagerar företrädesvis med komplex IgE. FceRI förmedlar det omedelbara överkänslighetsreaktionen hos många allergiska reaktioner genom att stimulera degranulering och frisättning av en rad inflammatoriska mediatorer på mastceller och basofiler ., FceRII finns både i en membranbunden form som levererar en nedreglerande signal för IgE-syntes , liksom lösliga fragment som genererar en motsatt uppreglering på IgE-syntes . Dess roll i trancytos av IgE-allergenkomplex i human luftväg och tarmepitelet undersöks aktivt som ett potentiellt mål för allergisk luftvägsinflammation som ett resultat av matallergier .
den enda medlemmen i IgA-receptorgruppen, FcaRI, uttrycks endast i celler av myeloid härstamning., Det spelar en roll i både pro – och antiinflammatoriska svar beroende på tillståndet hos IgA-bundet. Medan bindning av sekretoriska IgA (SIgA) närvarande vid mukosala ställen har antiinflammatoriska effekter, inklusive förebyggande av patogeninvasion, leder bindning av serum IgA till inflammatoriska svar. Fcari reglerar också neutrofil livskraft beroende på den inflammatoriska mikromiljön .
TRIM21 kan särskiljas från andra FCR eftersom det visar en bred antikroppsspecificitet. Det kan binda IgG, IgM och IgA . Det uttrycks också av celler av de flesta histogena lineages ., TRIM21 deltar i antikroppsmedierad interferens av virusreplikation genom att rikta cytosoliska virusantikroppskomplex för proteasomal nedbrytning.
bindning av Fc-domäner till FCR kan ha oönskade effekter i monoklonala antikroppsbaserade analysmetoder som immunhistokemi (IHC), fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) och kromatin immunoprecipitation (ChIP). Icke-specifik bindning till FCR kan leda till bakgrundsbrus som kan leda till upptäckt av falska positiva., Lösningar för att hantera detta problem inkluderar användning av (i) isotype kontroller för gating, (ii) serum för att i stort sett konkurrera om receptorerna som är involverade i icke‐specifik bindning, eller (iii) renad IgG för att blockera Fc-receptorer specifikt . Innovex Fc Receptor blocker #NB309 kan användas för att blockera paraffin eller frysta sektioner under IHC eller IC experiment eller BD Biosciences # 553142, Miltenyi Biotec Fc receptorblock för flödescytometri. Till exempel, Chopra S et al blockerade FcyR bindning med 5 µg/ml TruStain fcX (anti-mus-CD16/32, klon 93) från BioLegend under flödescytometri och cell sortering .,
dr.Macarena Fritz Kelly från São José dos Campos, SP, Brasilien, bidrog avsnittet Om Fc-receptorer i September, 2018.
Lämna ett svar