epilering inducerar hår-och hudpigmentering genom ett EDN3 / EDNRB-beroende regenerativt svar av melanocytstamceller

epilering inducerar hår och hud hyperpigmentering hos C57BL / 6J möss

i allmänhet visar hårsäckar på musens dorsala hud en synkroniserad första hårcykel15., Hårsäckarna på hela den dorsala huden är vanligtvis i anagen från postnatal dag 1-12, i catagen från dag 16-19, och i telogen därefter till nästa anagen11, 22, 23. För att visualisera hudpigmenteringsförändringar under den postnatala hårcykeln, depilerade vi dorsala stammen och huvudområdena av C57BL/6J-möss vid postnatal dag 11 (P11) (anagen vi-scenen i första hårcykeln), P21 (telogen) respektive P30. Som visas i Fig. 1A, hela huden var homogent svart vid P11 och homogent rosa vid P21., Intriguingly, men vid P30, hårbotten huden var fortfarande rosa medan tillbaka huden var svart (Fig. 1A). Dessa data tyder på att även om McSCs i hårbotten hårsäckar differentieras till mogna melanocyter under den första hårcykeln, de inte aktiveras för att regenerera melanocyter vid en tidpunkt då tillbaka hårsäckar är redan i anagen av den andra hårcykeln. Vi testade därför om epilering kan aktivera McSCs i hårbotten vid denna tidpunkt., Denna epileringsbehandling inducerade signifikant uttryck av inflammatoriska faktorer, men deras nivå är mycket lägre än den som induceras av sårskada, vilket tyder på att epilering endast inducerar en mild form av hudskada (Fig. S1). Intressant, när hårbotten hårstrån C57BL / 6J möss epilerades vid P21 (som nämnts, i telogen skede av den första hår cykel), hårbotten pigmentering ökade signifikant (6,06 ± 1,5 gånger, n = 9) redan 7 dagar senare, vid P28 (Fig. S2A, B) och epileringsområdet producerade en pigmenterad ö (Fig. 1B)., På motsvarande sätt hyperpigmenterades de epileringsinducerade regenererande håren (2,68 ± 0,87 gånger, n = 5) jämfört med hår av icke-epilerade kontroller (Fig. 1C,D). Dessa resultat indikerar att i hårbotten kan epilering inducera för tidig hudrepigmentering och hårhyperpigmentering.

eftersom håren fysiologiskt regenererar på baksidan av C57BL/6J möss under den första postnatala hårcykeln (Fig. 1A), vi undrade också om epilering skulle inducera förändringar i hårregenerering på baksidan. Faktum är att 7 dagar efter epilering vid P21 hyperpigmenterades det epilerade området jämfört med den oepilerade (Fig. S2C,D), liksom de individuella regenererade håren (Fig. S2E)., Dessa data tyder på att epileringsinducerad hyperpigmentering inte är begränsad till hårbotten. Med tanke på dessa observationer frågade vi också om effekterna av epileringsinducerad hyperpigmentering fortfarande skulle fungera hos gamla möss. Intriguingly, de regenererande håren på baksidan av 1,5-åriga möss blev signifikant hyperpigmenterade 30 dagar efter epilering (1,07 ± 0,08 gånger, n = 3), jämfört med de oepilerade vilande håren (0,84 ± 0,03) (Fig. 1E,F). Dessutom visade HPLC-analys att epilering inducerar eumelaninsyntes (1,79 ± 0,09 gånger, n = 3) istället för pheomelaninsyntes (0,97 ± 0.,12 gånger, n = 3) i bakre hår (Fig. S3). Detta tyder på att epilering inducerar aktivering av McSCs för att generera antingen mer mogna melanocyter, eller det ökar melaninsyntesen i mogna melanocyter i hårlökar av åldrade möss.

epilering-skada stimulerar McSC proliferation och inducerar generering av dermala och epidermala melanocyter och uttryck av melanogenesrelaterade gener

Med tanke på att melanogenes är kopplad till anagen24 undersökte vi om epileringsinducerad pigmentering i hårbotten orsakas av anageninduktion. Som visas i Fig., 2A, de epileringsinducerade hårsäckarna startade anagen omedelbart, medan hårsäckarna i icke-epilerade kontrollmöss förblev vid telogen under en längre tidsperiod. Därför svarade de quiescent hårfollikeln McSCs på epilering genom att bli aktiverad. Sju dagar efter epilering observerades pigmenterade melanocyter inte bara i mogna hårlökar utan även i dermis, öppningar av hårsäckar och interfollikulära epidermis (Fig. 2A)., På motsvarande sätt upptäcktes melanocytspecifika markörer som PMEL17 och TYR i de epileringsinducerade pigmenterade områdena men inte i kontroll av hårsäckar (Fig. S4A). Dessutom visade western blot data att nivåerna av de melanogenesrelaterade proteinerna TYRP1 (4,22 ± 0,96 gånger, n = 6) och TYR (9,75 ± 2,76 gånger, n = 6) båda ökade signifikant genom epilering (Fig. S4B och S9). Resultaten tyder på att epilering inte bara aktiverar McSCs utan också inducerar regenerering av melanocyter för att fylla interfollikulära områden.,

i den bakre huden, 7 dagar efter epilering vid P21, ökade det totala melanocytantalet i varje glödlampa (20 ± 1,9) signifikant jämfört med fysiologisk regenerering (15,7 ± 1,4) (Fig. 2B)., På motsvarande sätt fanns det också fler melanosomer i epileringsinducerade regenererade hårlökar än i fysiologiskt regenererade hårlökar (Fig. 2C och Fig. S4C,D). Dessa data tyder på att epilering inducerade McSC hyperproliferation under den första postnatala hårcykeln. Faktum är att 3 dagar efter epilering var McSCs proliferationshastigheten högre (86,2 ± 3,5% av cellerna var Ki67-positiva efter epilering jämfört med 45,6 ± 3,4% av cellerna positiva för Ki67 i kontroller) (Fig. 2D)., Intressant, KIT-positiva celler hittades inte i epidermis men de fanns i håret bula 1 dag efter epilering och tydligt närvarande i epidermis 3 dagar efter epilering (Fig. 2E och Fig. S5). Antalet Kit + – celler i epilerade epidermis (2,32 ± 0,72/sektion, n = 4) ökar signifikant jämfört med fysiologiska epidermis (0,77 ± 0,68/sektion, n = 4) (Fig. 2F). På motsvarande sätt, 7 dagar efter epilering, hittades pigmenterade celler också i epidermis (Fig. 2E-F)., Vidare avslöjade kvantitativ RT-PCR 7 dagar efter epilering induktion av många melanogenesrelaterade gener, inklusive Tyr (2,84 ± 1,13 fold over control, n = 3), Tyrp1 (3,89 ± 0,72 fold, n = 3), Mitf (3,47 ± 0,38 fold, n = 3), Sox10 (2,13 ± 1,13 fold, n = 3), Pax3 (3,18 ± 0,43 fold, n = 3) och Ednrb (3,28 ± 0,62 fold, n = 3) (Fig. S6A). Tillsammans föreslår dessa resultat att epilering inducerar McSCs-proliferation, migration i epidermis och stimulering av melanogenesprogrammet.,

epilering inducerar EDN3-uttryck i hårsäckar och epidermis

bland de gener som inducerades genom epilering var EDNRB av särskilt intresse på grund av dess välkända inblandning i regleringen av melanocytlinjeen1, 12. Nyligen har uttrycket av dess ligands Edn1 och Edn2 rapporterats öka under fysiologiska hår anagen, men dess ligand Edn3 uttryck påverkades inte12. Därför undrade vi om epilering av bakre hår skulle inducera dessa ligander., I bekräftelse på ovanstående resultat fann vi att under fysiologisk regenerering ökade uttrycket av Edn1 och Edn2 i bakskinnet vid P26, men Edn3-uttrycket visade ingen förändring (Fig. 3A och Fig. S11). Överraskande, men epilering inte bara inducerade uttrycket av Edn1 och Edn2 men också Edn3 (Fig. 3A), vars kodade produkt, EDN3, har tidigare visat sig vara involverad i melanocytutveckling1, 25, 26. Därför fokuserade vi vår studie på EDN3 och dess signalväg. Vi fann att nivån av EDN3-protein ökade signifikant i epilerad hud (d0, 0.,94 ± 0, 2 gånger; D3, 1, 81 ± 0, 09 gånger; D5, 4, 57 ± 0, 67 gånger; n = 6) men förblev låg i kontroll hud (d0, 1, 25 ± 0, 47 gånger; D3, 0, 83 ± 0, 14 gånger; D5, 1, 21 ± 0, 2 gånger; n = 6) (Fig. 3B och Fig. S12). Immunohistokemi visade att på epilering dag 1, EDN3 protein ökade i dermal papilla, epidermis, och sekundära hår groddar. På dag 7 ökade den också i hårsäckens öppningar (Fig. 3C). Regionerna med höga epileringsinducerade EDN3-nivåer var i nära kontakt med McSCs i sekundärhårgroddar (sHG) eller med hårlampans melanocyter., Med hjälp av vuxna heterozygot Ednrb Lacz /+ möss fann vi då att EDNRB uttrycks i pigmenterade melanocyter av hårlökar och i sHG, liknande uttrycket av Dct-lacZ i hårsäckar (Fig. 3D). Vidare visade immunostaining data att β-Gal-positiva celler var sammärkta med KIT-positiva celler i sHG och med MITF-positiva celler i hårlampa (Fig. 3E), vilket tyder på att EDNRB är uttryckt i McSCs och melanocyter., As expected, 7 days after epilation, western blot analysis and immunostaining data showed that Ednrb-lacZ expression is significantly increased in melanocytes (Figs S6B,C and S13). These results suggest that epilation induces EDN3, which then stimulates its receptor EDNRB to regulate McSCs and melanocytes.

EDN3 är välkänt för dess effekter på att stimulera tillväxten och differentieringen av melanocytprekursor1, 25, 26., Nyligen har transgen överexpression av EDN3 rapporterats för att förhindra hårgraying orsakad av upprepade epilering27, vilket tyder på att EDN3 också påverkar McSCs. För att undersöka effekten av EDN3 på McSCs, vi isolerade DCT+ celler från E16.5 vildtyps epidermis och stimulerade dem med EDN3 eller BQ788 (en EDNRB-hämmare). Som visas i Fig. S7a, stimulering med EDN3 ökar signifikant proliferationshastigheten för DCT+ – cellerna (från 43,7 ± 2% Upp till 61,4 ± 7,5%, n = 5), men denna effekt av EDN3 var helt blockerad av BQ788 (26,4 ± 1,56%, n = 5)., Baserat på de fakta som för unpigmented celler, DCT är en specifik markör för McSCs och att det inte finns någon gammal melanocyter i E16.5 epidermis4, 28, resultatet tyder på att EDN3/EDNRB krävs för McSC spridning.

Ednrb krävs för epileringsinducerad hår-och hudpigmentering

för att utvärdera vikten av EDNRB-signalering för epileringsinducerad hudhyperpigmentering använde vi homozygot Ednrb lacZ/ lacZ (Ednrb−/−) möss. Sådana möss är till stor del fria från pigmentceller men behåller pigmenterade fläckar vid basen av huvudet och svansen., Fjorton dagar efter epilering i huvudområdet hyperpigmenterades regenererande hår i wildtype− möss (2,41 ± 0,55 gånger, n = 5) men inte i Ednrb−/ – möss (Fig. 4A,B). I oepilerade Ednrb−/− möss var melaninnivåerna av håraxlar lägre (0,51 ± 0,06-faldig, n = 5) jämfört med de i kontroll wildtype-möss (1,02 ± 0,14-faldig, n = 5) (Fig. 4B). Dessutom ökade hudens repigmentering signifikant hos wildtype-möss, men endast något hos Ednrb−/− möss (Fig. 4C). Hudmelaninnivåerna inducerade genom epilering var signifikant lägre hos Ednrb – / – möss (1, 85 ± 0.,79 gånger, n = 9) jämfört med de hos wildtype-möss (5, 1 ± 0, 62 gånger, n = 9). Dessa resultat tyder på att radering av Ednrb stör epilering-inducerad hår hyperpigmentering och hud repigmentering. Vidare är förlust av EDNRB associerad med hårgraying. Melaninnivåerna av pigmenterade håraxlar av Ednrb – / – möss reducerades mellan en månads ålder (0,96 ± 0,1 gånger, n = 4) och upp till 12 månaders ålder (0,37 ± 0,12 gånger, n = 4), i motsats till deras nivåer i håraxlar av wildtype-möss (1,96 ± 0,17 gånger, N = 4 vid en månad; 2,15 ± 0,43 gånger, n = 4, vid 12 månader) (Fig. S7B).,

för att undersöka om EDNRB-signalering krävs för epileringsinducerad hyperpigmentering i bakhuden utförde vi intradermal injektion av BQ788 efter epilering av wildtype-möss. Som visas i Fig., 4D, medan kontroll intradermal injektion av NaCl efter epilering tillåts för hud hyperpigmentering (från 0,23 ± 0,06 gånger upp till 1,0 ± 0,15 gånger, n = 3), injektion av BQ788 minskade signifikant epileringsinducerad hudpigmentering (0,76 ± 0,1 gånger, n = 3). Detta fynd tyder på att farmakologisk störning av EDNRB kan blockera epileringsinducerad hudhyperpigmentering i bakhuden. Sammantaget tyder dessa data på att EDNRB-signalering krävs för epileringsinducerad hyperpigmentering.,

EDNRB påverkar McSC spridning i hårsäckarna och reglerar melanogenesis-relaterade genuttryck

för Att undersöka hur avsaknaden av Ednrb minskar pigmentering, vi histologiskt analyseras pigmentering av hår hårsäckarna i hårbotten (vilket, som nämnts, fortfarande pigmenterade i Ednrb−/− möss i motsats till tillbaka). Som visas i Fig., 5a, på dag 5 efter epilering, var hårlökar och håraxlar av Ednrb−/− möss normalt närvarande i hårbotten men hypopigmenterades jämfört med de av wildtype-möss, vilket tyder på att förlust av EDNRB inte påverkar hårcykeln men minskar melanocyttal eller melaninsyntes i glödlampan. Faktum är att 7 dagar efter epilering var melanosomantalet Ednrb – / – möss mycket lägre än för wildtype-möss (Fig. 5B)., Dessutom kunde melanocytspecifika markörer som PMEL17 och TYR inte detekteras i dermis, öppningar av hårsäckar eller interfollikulära epidermis hos Ednrb−/− möss 5 dagar efter epilering, även om de var närvarande vid låga nivåer i hårlökar (Fig. S7C). Dessutom var McSC-markörsatsen och pigmenterade melanocyter oupptäckbara även 7 dagar efter epilering (Fig. 5C och Fig. S7D). Dessa resultat föreslog att EDNRB krävs för epileringsinducerad epidermal melanocytregenerering.,

för att analysera hur förlusten av EDNRB minskar melaninnivån av hårlökar, kvantifierade vi sedan melanocyttal i varje hårlampa av wildtype och Ednrb− / − möss 7 dagar efter epilering., Antalet MITF-positiva celler vid epilering var lägre i varje hårfollikel hos Ednrb – / – möss (11,7 ± 2,2) jämfört med hårsäckar hos wildtype-möss (15,7 ± 1,43) (Fig. S7D). Detta resultat föreslog att förlust av EDNRB kunde blockera epileringsinducerad proliferation av melanocyt lineage-celler. Nyligen Takeo et al. fann att under fysiologisk hårregenerering krävs EDNRB-signalering också för McSCs-proliferation och underhåll29. Ändå var det fortfarande okänt om EDNRB påverkar epilationsinducerad mcsc-proliferation., Eftersom EDN3 uttrycks i dermal papilla i närheten av mogna melanocyter i hårlampan testade vi om EDN3 / EDNRB-signalering påverkar McSC-proliferation i Bulan eller stimulerar melaninsyntesen i follikulära melanocyter. I hårbotten, anti-KIT och Ki67 immunostaining data visade att 3 dagar efter epilering, McSC spridning i varje hår bula i Ednrb−/− möss (52 ± 5,2 procent) var lägre än motsvarande utbuktningar i vildtyps-möss (86.2 ą 3,5%) (Fig. 5D). Detta tyder på att EDNRB också krävs för epileringsinducerad McSC-proliferation i hårbulgen.,

för att få ytterligare insikter i de underliggande mekanismerna isolerade vi melanocyter för in vitro-odling. Som visas i Fig. 5e, pigmentering av Ednrb – / – primära melanocyter från pigmenterade hårsäckar i huvudet P6 Ednrb – / – möss var lägre (0,47 ± 0,1 gånger, n = 5) än för wildtype primära melanocyter (1,0 ± 0,1 gånger, n = 5). Liknande resultat erhölls i cellpellets eller när melaninhalten mättes direkt (Fig. 5F). Vi analyserade sedan om EDNRB signalering skulle påverka uttrycket av melanogenesrelaterade gener. Som visas i Fig., 5g, på dag 7 efter epilering, minskade uttrycket av melanogenesrelaterade gener i Ednrb – / – hårbotten, inklusive uttryck av Pax3 (0.47 ± 0.07 fold, n = 3), Tyr (0.55 ± 0.05 fold, n = 3) och Tyrp1 (0.5 ± 0.02 fold, n = 3). Detta tyder på att EDN3/EDNRB signalering är inblandade i både melanocytstimulerande spridning och melanogenesis under epilering-inducerad regenerativ svar av McSCs. Sammantaget indikerar dessa fynd att epilering inducerar melanogenesrelaterade genuttryck genom EDN3 / EDNRB-signalering och leder i sin tur till hud-och hårhyperpigmentering.