gränser i pediatrik

introduktion

bakre urinrörsventiler (PUV) är den vanligaste medfödda orsaken till obstruktion av urinblåsan (1). Medan dödligheten från PUV har förbättrats avsevärt med modern medicinsk hantering, är obstruktiv uropati fortfarande en signifikant källa till sjuklighet i vuxen ålder (2). Upp till 80% av barn med PUV visar symtom på inkontinens och urinvägsinfektioner (3)., Vidare kommer upp till 50% av barn med PUV att utveckla njursvikt, med obstruktiv uropati den vanligaste medfödda orsaken till njurtransplantation (4). De obstruktiva ventilbladen behandlas kirurgiskt strax efter födseln; barn med PUV kommer dock att utveckla variabilitet i urinblåsfunktionen under hela livet. Det har visat sig att blåsförsämring ofta uppstår efter puberteten, med ett ökande behov av ren intermittent kateterisering (5).

studier som använder olika djurmodeller har visat att blåsan är hormonellt känslig., Specifikt har testosteronersättning visat sig öka glattmuskelmassan och glattmuskel-kollagenförhållandet i orchiektomiserade råttor (6). En modell av partiell blåsutsläppsobstruktion hos manliga möss studerades och visades producera blåsdetrusormuskelhypertrofi (7). Testosteron har visat sig öka detrusorfibros som svar på ischemi – reperfusionsskada hos kastrerade kaniner (8). Hittills har emellertid effekten av hormonella manipuleringar på svaret från den manliga musblåsan till skada som produceras av obstruktion ännu inte studerats., Därför antar vi att testosteron deltar i de maladaptiva fibrotiska förändringarna som uppstår efter obstruktion av blåsans utlopp.

material och metoder

Murin partiell Blåsutsläpp obstruktion Modell

alla kirurgiska ingrepp godkändes av Animal Care and Use kommittén för Stanley Manne Children ’ s Research Institute. Åtta till tio veckor CD1 manliga möss (Charles River Labs, Chicago, IL, USA) var inrymda i separata burar för att undvika förändringar i testosteronnivåerna orsakade av grupphus. Möss bedövades med 3% isofluran och placerade liggande., Underlivet rakades och förbereddes med providon-jodlösning. Efter att ha säkerställt tillfredsställande induktion av anestesi gjordes ett snitt i nedre bukhuden och utfördes genom bukväggen. Blåsutsläppsobstruktion utfördes på ett sätt som liknar en tidigare rapport, men med vissa skillnader (partiell obstruktion eller PO-Grupp) (7). Observera att partiell obstruktion vanligtvis kallas ”pBOO”, men vi kommer att hänvisa till kirurgi och experimentell grupp som PO., Med uppåtriktad dragkraft på blåsan utfördes trubbig dissektion runt blåshalsen (proximal mot prostata hos manliga möss) medan den ibland återtog blåsan caudally för att säkerställa dissektion att vara främre mot urinledarna. En 7-0 polypropylen sutur passerade sedan runt blåshalsen och bundet ner över en 23-gauge nål placerad bredvid urinröret. Nålen avlägsnades sedan., Om manliga djur skulle kastreras (kastrerad partiell obstruktion eller CPO), samtidigt testiklarna togs ut ur buken snitt, de spermatiska sladdar ligerades med 6-0 polypropen suturer och kraftigt uppdelad. Bukväggen och huden stängdes sedan separat med 5-0 polyglactin suturer på ett avbrutet sätt. Sham djur genomgick ett identiskt förfarande fram till blåsans mobilisering. Djur fick återhämta sig, förutsatt att karprofen upplöstes i dricksvatten och offrades vid 1 eller 4 veckor efter funktionella studier som beskrivs nedan., Efter offer av cervikal ryggradsförskjutning under isoflurananestesi vägdes djur och blåsor dissekerades ut vid ligaturens nivå. Varje urinblåsa tömdes av urin och vägdes sedan separat för 12 sham, 17 PO, 11 CPO och 11 CPOT-möss.

Testosteronadministrering

testosteroncypionat administrerades till kastratet, delvis blockerad grupp vid tidpunkten för kastrering och veckovis postoperativt vid dos av 10 mg / kg (kastrerad partiell obstruktion testosteron eller CPOT-grupp)., För möss som fick testosteronersättning drogs blod vid offertiden och skickades för kommersiell testosteronanalys för att säkerställa att de fick adekvat ersättning (Antech Diagnostics, Irvine, CA, USA).

tömning fläck på papper (VSOP)

VSOP utfördes morgnarna i postoperativa dagar 1, 7 och 28 för varje mus. Möss upprätthölls i metaboliska burar med underliggande Whatman filterpapper för 2 h och ges obegränsad tillgång till mat och vatten. Filterpappersark avbildades., Antal och mönster av hålrum noterades och området för varje tömningsfläck mättes med ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA). Med hjälp av en standardkurva som skapats från tömning fläckar från kända volymer av urin, fläcken området omvandlades till tömd volym. Max annulleras volym analyserades.

histologisk analys

blåsor fixerades i 10% (w/V) formalin (Sigma) för 24 h, inbäddad i paraffin och skärs tvärs med blåshalsen orienterad ner för att producera 4 µm sektioner. Sektioner från 4 sham, 4 PO, 4 CPO och 4 CPOT-möss färgades med Massons trichrome., Sektioner avbildades vid 10× och 40× förstoring med ett Leica upprätt mikroskop anslutet till en kamera och bilder lagrades digitalt med OpenLab för Mac. Col / SM-förhållandet kvantifierades med hjälp av Adobe Photoshop som tidigare beskrivits och i genomsnitt från fyra 40× sektioner per blåsan. För immunostaining fixerades blåsor i 4% (w/v) formaldehyd gjord av paraformaldehyd (EM Sciences) över natten. Vävnaden tvättades i DPBS och jämviktades sekventiellt i 20% (w/V) och 30% (w/V) sackaros (Sigma) I DPBS., Vävnader frystes i avlägsna formar innehållande OCT (Tissue Tech) i ett torris isopentan (Sigma) bad.

Immunofluorescensantikroppar

fasta blåsor från 3 sham, 3 PO, 3 CPO och 3 CPOT-möss användes. Sektioner av 10 µm från klipptes för alla experiment. Sektioner tvättades två gånger i PBS, inkuberades i 5 min vid rumstemperatur i PBS + 0.1% Tween (PBT) och blockerades i 30 min vid rumstemperatur med 10% donkey serum i PBT., Glatt muskulatur myosin (SMM) detekterades på samma sätt med hjälp av kanin anti-glatt muskulatur myosin (Biomedicinsk teknik, 1: 100) i samband med Alexa Fluor 546 donkey anti-kanin sekundär antikropp (Life Technologies, 1:400).

statistisk analys

grupper jämfördes med ANOVA med post hoc Student–Newman–Keuls analys. Resultat med p< 0,05 ansågs signifikanta. SPSS v22. 0 användes för statistisk analys. Felstaplar i siffrorna SEM.,

resultat

PO leder till funktionella förändringar som bestäms av urodynamiska studier och tömning fläck på papper

partiell blåsutsläppsobstruktion utfördes på manliga CD-1-Möss och jämfört med två grupper: manliga möss som genomgår sham-kirurgi och manliga möss som genomgår partiell blåsutsläppsobstruktion med kastrering. Vi mätte serumtestosteronnivåer i kastrerade Möss och fann att nivåerna sjönk till (<20 pg/dL) inom 24 h efter orchiektomi., Effekterna av obstruktion på blåsfunktionen bestämdes med användning av urodynamiska studier i dessa tre grupper. Figur 1A visar förhöjda maximala tömningstryck 1 vecka efter obstruktion i PO och CPO möss jämfört med sham kirurgi möss. Representativa urodynamiska spår visar också instabilitet vid 1 vecka hos PO och CPO-möss (figur 1C). VSOP utförs vid 1 vecka efter obstruktion återspeglar effekten av obstruktion på PO och CPO möss som inte ses i sham kirurgi möss (figurerna 1B,D)., Således hade vår modell av PO signifikanta funktionella effekter på mikturition hos både PO och CPO-möss 1 vecka efter operationen.

även om obstruktion hos CPO-möss visades vid 1 vecka, löstes effekterna av obstruktion med 4 veckor. VSOP gjort vid 4 veckor efter obstruktion visar att PO-möss har ihållande obstruktiva tömningsmönster med mindre maximala voided volymer än CPO-möss. Samtidigt återställer CPO-möss maximala voided volymer som liknar sham surgery mice (figurerna 3a–C)., Det övergripande mönstret på VSOP av CPO-möss har återgått till normalt medan PO-möss fortsätter att visa indiskret sprutning av urin som indikerar förlust av blåskontroll.

Blåsremodellering efter PO ändras genom kastrering

Vi fann att effekter på blåsfunktionen var korrelerade med makroskopiska förändringar i musblåsan på PO och CPO-möss. Vid tidpunkten för mus offer vid 4 veckor efter PO, sham blåsor verkade normal i storlek, men PO och CPO blåsan var grovt förstorade (figurerna 2a,C–E)., Efter dissektion av blåsan distal till blåshalsen ligatur uttrycktes blåsor av urin och vägdes. Här fann vi ökad blåsvikt i po-mössen jämfört med både sham-operationen och CPO-möss. CPO-möss uppvisade ingen ökad vikt jämfört med Sham surgery mus (Figur 2B). Histologisk utvärdering av blåsor av dessa möss utfördes med h&e färgning och blåsarea, omkrets och tjocklek jämfördes., Både CPO och PO-möss visade ökat område och omkrets jämfört med sham-operationsmöss, vilket återspeglar förändringar från förhöjda blåstryck efter PO (figurerna 2F,H). Ökad blåstjocklek sågs emellertid endast hos PO-möss (figur 2G). Detta korrelerade med de lägre blåsvikterna hos CPO-möss, vilket tyder på att ökningen av blåsans storlek främst beror på ”sträckning” av blåsmuskeln i motsats till sann blåsmuskelhypertrofi eller hyperplasi.

Blåsfibros ökar efter partiell Blåsutsläppsobstruktion

för att undersöka om ökningen av blåsans massa och blåsans väggtjocklek berodde på enbart muskelhypertrofi / hyperplasi eller om en komponent av fibros var inblandad, utfördes histologisk undersökning av sham, PO och CPO musblåsare vid 4 veckor efter obstruktion. Detta gjordes med användning av både Masson trichrome färgning samt fibros markörspecifikt immunofluorescens (Figur 4)., Som förväntat, hos PO-möss, efter obstruktion, visade sig blåsorna ha ökade kol / SM-förhållanden. Med kastrering hittades inte längre det ökade Col/SM-förhållandet (figur 4B). Även om luminalblåsans volym ökade hos CPO-möss, visade muskelskiktet inte hypertrofi vilket framgår av att ha samma blåsväggtjocklek som sham-kirurgiska möss. Vidare visade utvärdering av fibros-specifika markörer Vimentin, Col1a1 och FSP-1 genom immunofluorescens ökat uttryck hos po-möss jämfört med sham-möss, med en motsvarande minskning av uttryck i CPO-möss., Det verkar som att kastrering skapar förhållanden där icke-fibrotisk blåsremodellering uppstår och argumenterar för en potentiell roll av testosteron specifikt för att mediera ett fibrotiskt svar på blåsskada.

introduktion av exogent testosteron reverserar de positiva effekterna av kastrering efter partiell Blåsutsläpp obstruktion

Vi har visat att kastrering i inställningen av PO kommer att dämpa post-obstruktiv ombyggnad när det gäller blåshypertrofi / hyperplasi och fibros. För att visa att detta är ett testosteronspecifikt svar, efter kastration, genomgick en kohort av möss PO och testosterontillskott. Här använde vi antingen testosteron eller dess reducerade produkt dihydrotestosteron (DHT)., DHT har 10 gånger affiniteten för androgenreceptorn jämfört med testosteron och kan inte aromatiseras till östrogen, vilket minskar sannolikheten för att de förändringar som uppstår från testosterontillskott beror på ökande östrogennivåer. Max voided volymer som bestämdes av VSOP var signifikant lägre i CPO plus testosteron (CPOT) eller CPO plus DHT (CPOD) möss jämfört med CPO möss (figur 5A). Makroskopiska och mikroskopiska förändringar ses i PO-möss (men inte CPO möss) återkom i CPOT och CPOD blåsor., Blåsvikterna ökade signifikant hos CPOT och cpod-möss jämfört med CPO-möss (figur 5B). CPOT och CPOD blåsor hade också ökat Col/SM nyckeltal jämfört med CPO (Figur 5D). Fibros markörer ökade också i CPOT och CPOD jämfört med CPO blåsor som var en reaktion på Masson ’ s trikrom fläcken (Figur 5C,E). Dessa fynd visar att exogen ersättning av testosteron i kastrerade manliga möss helt återställt de patologiska effekterna av obstruktion till urinblåsan., Sammanfattningsvis stöder effekterna av kastrering och testosteronersättning starkt en roll för manlig androgen i patogenesen av blåsobstruktion.

diskussion

pojkar födda med PUV genomgår kirurgisk resektion av de obstruktiva broschyrerna strax efter leveransen. Trots att lindra blåsutsläppsobstruktionen hos dessa barn utvecklas många patienter med PUV till blåsförsämring som kräver ren intermittent kateterisering för att tömma blåsan tillräckligt (3). Dessa förändringar sågs ofta efter puberteten., De kliniska förändringarna hos patienter med resekterade ventiler var tidigare hänförliga till fysiologiska förändringar i samband med ungdomar, såsom ökad urinfiltrering och inte till hormonella förändringar (1, 5, 9). Men våra resultat tyder på att androgen kan spela en viktigare roll än tidigare uppskattat. Vi finner att närvaron eller frånvaron av androgen specifikt påverkar de cellulära förändringarna som uppstår efter obstruktion, särskilt fibros.,

Information från studier där testosteron kompletterades hos patienter med lägre urinvägssjukdom kan ge insikt om effekterna av androgen på blåsesjukdom. Dessa data är relativt glesa, kommer till stor del från retrospektiva eller blivande observationsstudier och studier där testosteron administrerades till hypogonadal eller eugonadal män. Dessa studier tyder dock på att testosterontillskott inte förvärrar LUTS (10, 11)., Specifikt har flera studier visat en förbättring av IPSS-poäng hos män som fick androgentillskott, även om många av dessa inte specifikt studerade män med känd blåsutsläppsobstruktion, utan snarare inkluderar en kohort behandlad med testosterontillskott och har varierande grader av lutar vid baslinjen. En studie uteslöt patienter med känd obstruktion i blåshalsen. Koritsiadis et al., jämförde specifikt symtom och urodynamiska parametrar på tryckflödesstudier av hypogonadala och eugonadala män och fann serumtestosteronnivå att vara negativt korrelerad med detrusortrycket vid maxflöde, men inte IPSS eller andra urodynamiska parametrar (12).

effekten av testosteron på blåsan detrusor muskel har också studerats i djurmodeller. Tek och kollegor fann att testosterontillskott av kirurgiskt kastrerade råttor resulterade i ett minskat kollagen till glattmuskelförhållande och ökad cystometrisk kapacitet (13). Shortliffe et al., (14) fann att testosteronersättning hos kirurgiskt kastrerade råttor också var associerad med ökad blåsans glattmuskel samt ökad blåsmassa (14). Tillsammans indikerar dessa studier att i fria råttor stimulerar testosteron detruseller glatt muskeltillväxt genom en fortfarande oklart mekanism. I en ischemi – reperfusion blåsskada modell hos manliga kaniner, Chuang et al. visade att kastrering var skyddande genom att minska blåsfibros och minskade uttryck för olika fibros-relaterade markörer (8)., Testosterontillskott av dessa kastrerade kaniner ledde till ökad detrusorfibros efter blåsskada. Våra resultat speglar dessa fynd och representerar den första studien av effekten av testosteron på svaret på blåsskada från PO hos juvenila möss.

samtidigt gjorde bristen på fynd i litteraturen oss överraskad av våra första resultat. En potentiell oro vi hade var att mössen inte var tillräckligt hindrade och att våra resultat i kastrerade möss representerade en grupp där obstruktion helt enkelt inte uppstod., I slutändan vet vi att detta inte är sant eftersom blåsor i CPO-gruppen ursprungligen hade tömningsfläckar som den obstruerade gruppen, hade onormala tryck av cystometri och hade ombyggda blåsor. Faktum är att blåsarna från CPO-möss var mycket olika än shams, vilket indikerar att PO-operationen gav djupgående effekter. Vår tolkning av dessa fynd är att under timmarna efter operationen ökar trycket inom blåsväggen och att i normala möss är kollagener och andra förstyvande matriser konstruerade för att förhindra bristning av blåsan i buken., Blåsor från CPO-möss hade mycket liten avsättning av kollagen inom detrusor-muskeln men blev samtidigt mycket stora med tunna väggar. Det är möjligt att när det fibrotiska svaret försämras i en högtrycksblåsan sträcker den sig för att rymma urinen som ackumuleras. Detta är typiskt för vad vi observerat i CPO, men inte PO och CPOT blåsor. Således antar vi att testosterons roll specifikt kan vara att mediera fibros i blåsväggen.,

medan vårt arbete specifikt utnyttjade en blåsmodell för att bestämma testosterons roll på muskelfibros som svar på glatt muskelskada, tror vi att denna forskning kommer att visa sig vara viktig i många fibrotiska sjukdomsprocesser som har en sexförening. Faktum är att detta har stödts av några studier i litteraturen. Cho et al. visade att orchiektomi försvagade njur fibros ses efter ureteral obstruktion. I en musmodell av ensidig ureteral obstruktion visade njurar från manliga möss ökat uttryck för Alfa-SMA och kollagenavsättning (15)., I likhet med vår blåsmodell av obstruktion minimerades detta fibrotiska svar om samtidig orchiektomi utfördes med ureteral obstruktion. Analoga fynd rapporterades i en musmodell av hjärtfibros sekundärt till trycköverbelastning. Här dämpades fibrotiska förändringar i vänster ventrikel genom orchiektomi. Detta inkluderade en avtrubbning av TGFß signalvägen, känd för att vara viktig för att främja myofibroblastdifferentiering (16). Åldersrelaterad hjärt – och njurfibros försvagades också av orchiektomi hos manliga möss (17)., Vidare, i en studie av Zhu och kollegor, androgenreceptorn på vaskulära glatta muskelceller var inblandad i testosteron-stimulerad glatt muskulatur förkalkning. Med hjälp av en vaskulär glattmuskelceller härledda från en glatt muskulatur-specifik androgenreceptor knockout mus, förkalkning var trubbig som svar på testosteronbehandling jämfört med vilda typ glattmuskelceller (18). Således finner ett ökande antal studier, inklusive vår, ett samband mellan testosteron och de patologiska förändringarna i samband med fibros.,

mekanismen bakom testosterons roll vid modulering av detrusor-svaret på skada förblir oförklarlig. Ytterligare arbete som undersöker nedströms effekterna av testosteron i detrusor muskel kunde avslöja nya terapeutiska mål som skulle kunna utnyttjas för att förhindra eller åtminstone förbättra den negativa vävnadsremodellering som ses i inställningen av PO. Dessutom kunde dosresponsstudier utföras för att bestämma vid vilka serumkoncentrationer av testosteron leder till negativ ombyggnad. Östrogen har visat sig dämpa vävnadshypoxi och tillhörande detrusor skada i djurmodeller., Ytterligare studie av samspelet mellan testosteron och östrogen vid modulering av detrusor muskelsvaret på skada kan också bidra till att ytterligare belysa denna väg.

slutsats

juvenila hanmöss med partiell blåsutsläppsobstruktion har mindre högtrycksblåsor som är fibrotiska. Kastrering var associerad med större voided volymer, lägre blåsvikt och mindre detrusor fibros. Byte av testosteron i kastrerade möss omvända dessa effekter., Detta indikerar att testosteron spelar en roll för att modifiera förändringar till detrusor muskel efter partiell blåsutsläppsobstruktion hos möss. Således föreslår vi att ökade nivåer av testosteron hos pojkar med PUV kan bidra till den minskade blåsfunktionen.

Ethics Statement

denna studie utfördes i enlighet med rekommendationerna från kirurgiska riktlinjer, djurvård och Användningskommitté. Protokollet godkändes av Djurvårdsnämnden.

Författarbidrag

af, PF, DB, NK och GS datainsamling och analys., Af, PF, RD, och t.ex. befruktning, design och manuskript skrivande.

intressekonflikt uttalande

författarna förklarar att forskningen genomfördes i avsaknad av kommersiella eller finansiella relationer som kan tolkas som en potentiell intressekonflikt.

finansiering

denna forskning stöddes av finansiering från Hartwell Association till EG.