Gränserna i Mikrobiologi

Inledning

Bacillus thuringiensis och den andra 7 arter av spore bildar Gram-positiva bakterier, inklusive B. cereus, B. cytotoxicus, B. anthracis, B. pseudomycoides, B. weihenstephanensis, B. toyonensis, och B. mycoidesare, är i första hand detekteras i jord. Eftersom dessa bakterier är mycket lika i genotyp och fenotyp, bakterierna klassificeras som B. cereus grupp i taxonomi (Park et al., 2007). B., cereus och B. thuringiensis är mycket detekterbara i livsmedel eftersom de observeras i råvaror från jordbruksmark under odling och distribution. Dessutom är dessa två bakterier vanligtvis inte diskriminerade i klinisk diagnostik. B. cereus är en andra riskprioriterad grupp av livsmedelsburna sjukdomar i färska jordbruksprodukter, och dess kontaminering är ett av de största problemen i grönsaker (Felício et al., 2015). I synnerhet B., thuringiensis användes som bekämpningsmedel vid odling av vissa grödor och det är välkänt som mikrobiella insekticider som har använts för att minska mängden kemiska bekämpningsmedel (Azmi et al., 2015).

B. thuringiensis producerar insekticidala proteiner, vilka är den huvudsakliga typen av kristallina (Cry) proteiner (Kutasi et al., 2016). Omvänt leder aktivt växande vegetativa celler som saknar kristallproduktion till giftfria effekter. Δ-endotoxinerna innehåller huvudsakligen cytolytiska (Cyt) och Cry (Elleuch et al. År 2015; Rao et al., 2015)., Cyt och Cry har dock olika sekvenshomologier även om de består av liknande verkningssätt mot celllys, vilket leder till permanent skada på insektsmidgut (Adang et al., 2014).

Den strukturella variationen av fyra δ-endotoxins (Cry1, Cry2, Cry3, och Cyt2Ah) observerades av röntgenkristallografi (Dehury et al., 2013). Dessa gener identifieras i transgen bomull och andra grönsaker, som är betydligt effektiva för att kontrollera skadedjur., Utformningen av en biomarkör för den översatta produkten varierar med de olika kategorierna av cryprotein; därför kommer detekteringen att vara komplex. 16S rRNA-genen sekvenser baserade på universella primers visade hög likhet (>99%) index mellan bacillus anthracis (Böhm et al., 2015), som inte kan klassificeras med hjälp av genetiska och fenotypiska analyser (Peng et al., 2015). Vidare har det sedan 2000 diskuterats huruvida hela B. cereus-gruppen bör behandlas som en komplex art av olika bakterier (Helgason et al.,, 2000; Bartoszewicz och Marjańska, 2017). Det finns också förslag om att några av dessa bakterier är bättre anpassat till deras ekologiska egenskaper (psychrotolerance, virulens) än att taxonomisk tillhörighet (Drewnowska och Swiecicka, 2013; Bartoszewicz och Marjańska, 2017). För att lösa detta problem riktade vi XRE för att upptäcka B. thuringiensis, som kontrollerar den huvudsakliga typen av kristallproteinproduktion.

dessa två bakterier är mycket lika i biokemiska resultat (Böhm et al. År 2015), och genetiska egenskaper (Osman et al., 2015). Cho et al., (2015) rapporterade också att de genetiska och fenotypiska egenskaperna mellan dessa bakterier knappt kan särskiljas. Vidare, Pfrurunder et al. rapporterade att B. cereus grupp arter som inte tillförlitligt kan identifieras med hjälp av klassisk biotyping (Pfrunder et al., 2016). Baserat på dessa kanske de biokemiska experimenten inte räcker för differentiering. I stället användes närvaron av ett insekticidalt kristallprotein som en framstående egenskap för att differentiera dessa bakterier (Ekino et al., 2014; Wei m.fl., 2018).,

några av de faktorer som skiljer dessa två bakterier är baserade på deras patogenicitet i prover. B. cereus orsakar gastrointestinala störningar, medan B. thuringiensis också har varit involverad i epidemier av diarré. Som rapporterats är den särskiljande egenskapen hos B. thuringiensis närvaron av insekticidala kristallproteiner (δ-endotoxin) krypterade av gråtgener (Osman et al. År 2015; Albright et al., 2016). Eftersom identifieringsmetoden med hjälp av biomarkören för differentiering B., cereus-gruppen är komplex och tidskrävande, en högeffektiv biomarkör behövs brådskande för att ersätta de tidigare som gav en lägre effektivitet och ibland till och med visade falska resultat. Baserat på två specifika gener, den transkriptionella regulator och crystal protein gener för B. thuringiensis (Porcar och Juárez-Pérez, 2003; Han et al., 2006), den nuvarande studien utfördes för att inspektera och jämföra effektiviteten hos den konstruerade biomarkören (XRE) med den befintliga kristallproteinmarkören (cry2) för att identifiera B. thuringiensis från B. cereus group strains (BCG) och non-B., cereus – gruppstammar (icke-b) i livsmedel. cry2är det vanligaste kristallproteinet som finns i B. thuringiensis (Liang et al., 2011; Palma et al., 2014).

material och metoder

Bakteriekulturberedning

alla 120 stammar, inklusive 111 av Bcg och 9 Icke-B, erhölls från bakteriesamlingar i USA och Sydkorea (Tilläggstabell 1). Bland samlingarna användes B. thuringiensis ATCC 10792 (typstam) för optimering av experimentella förhållanden för konventionell PCR och realtids PCR., Alla stammar tinades vid rumstemperatur (25°C) och strejkade på näringsagar (Difco, MI, USA). Efter odling i 24 timmar vid 35 ° C i inkubatorn plockades en ren koloni och ympades i tryptisk sojabuljong (Difco, MI, USA) och övernattningskulturer användes för efterföljande experiment.

Primer Design och DNA isolering

respektive primers inriktning XRE för differentiering B., thuringiensis (Tabell 1) utformades enligt följande sekvens i Bacillus thuringiensis ATCC 10792 (Gen – 3664610-3665047) Primer Express® – Programvaran (Version 3.0.1) från Applied Biosystems ligger i KALIFORNIEN, Usa och syntetiseras av Bioneer Corporation från Gwangju, Sydkorea. Utförandet av designad XRE jämfördes med cry2 (Ben-Dov et al., 1997). Efter 24 timmars anrikning i TSB utsattes en alikvot av 1 mL bakterier för genomisk DNA-extraktion med användning av PrepMan® Ultra-Provpreparat reagens (Applied Biosystems, CA, United States)., DNA-koncentrationer mättes genom Eppendorf BioSpectrometer® fluorescens (Eppendorf, Hamburg, Tyskland) och justeras till 10 ng/µL. DNA-prover lagrades vid -20 ° C före användning.

konventionell PCR-och realtids PCR-analys

den konventionella PCR framställdes med en C1000 TouchTM termisk cykler från Bio-Rad belägen i Hemel Hempstead, Storbritannien., Reaktionsröret för PCR används för Accu-Power® Pyro Hot Start-Taq-PCR Pre-Mix från Bioneer Corporation ligger i Daejeon, Sydkorea och en volym på 20 µL, inklusive 1 µL av varje primer (10 pmoL/µL) och 2 µL DNA. Amplifieringsförhållandena för den konventionella PCR för transkriptionsregulator (XRE) var: initial denaturering vid 95°C i 5 min, följt av 35 cykler av denaturering vid 95°C för 30 s, glödgning vid 49°C för 30 s och förlängning vid 72°C för 30 s, och en slutlig förlängning vid 72°C i 5 min., Amplifieringsförhållanden för kristallprotein (Cry 2) var: initial denaturering vid 95°C under 5 min, följt av 35 cykler av denaturering vid 95°C under 30 s, glödgning vid 55°C under 30 s och förlängning vid 72°C under 1 min, och en slutlig förlängning vid 72°C under 5 min. Efter DNA-förstärkningar, 1.5% (W/V) agarosgellösning innehållande RedsafeTM Nukleinsyralösning 20,000 × (Intron Biotechnology, Inc.) framställdes och gelelektrofores utfördes med användning av Subcellmodell 192 från Bio-Rad belägen i Hemel Hempstead, Storbritannien., Banden visualiserades med Smart View Pro Uvci-1100 Imager system från Major Science i CA, USA. Noggrannheten (AC) användes för att utvärdera PCR-metoden med hjälp av primers XRE och cry2 vid detektering av B. thuringiensis från Bcg och icke-B. Negative agreement (NA) betyder samma negativa resultat för icke-B. thuringiensis med PCR med XRE och cry2. Positiv överensstämmelse (PA) betyder samma positiva resultat för B. thuringiensis med PCR med XRE och cry2. Noggrannheten (AC) mäts med följande ekvation, AC = ×100% (Ma et al., 2014).,

real-time PCR-experiment utfördes av StepOneTM real-time PCR-systemet från Applied Biosystems belägna i CA, USA. En reaktionsvolym på 20 µL bestående av 10 µL Melt DoctorTM High Resolution Melting (HRM) Master Mix, 2 µL DNA, 0,5 µL av f/R-primern (10 pmoL/µL) (Tabell 2). Amplifieringsförhållandena för qPCR var: initial denaturering vid 95 ° C för 10 min och 40 cykler vid 95 ° C för 15 S och 60 ° C för 1 min. Därefter sattes temperaturen i den efterföljande smältkurvananalysen att höja från 60 till 95 ° C vid 0,3 ° C/cykel för att testa primerns specificitet.,

utvärdering av PCR-analys i realtid

prestandan hos XRE och cry2 utvärderades med 50 B. thuringiensis-stammar, medan exklusiviteten testades med 70 bakterier som inte är målarter, inklusive 58 B. cereus (Bc), 3 Bcg och 9 Icke-B (Chelliah et al., 2017). En standardkurva gjordes med användning av 10-faldiga utspädningar av DNA extraherat från B. thuringiensis ATCC 10792., DNA-koncentrationerna justerades från 10 ng / µL till 100 fg / µL, vilket motsvarar 2,6 × 106 till 2,6 × 10 CFU, och förstärkningarna utfördes av realtids-PCR med tre exemplar. För negativa kontroller användes destillerat vatten. Negativa resultat eller inga amplifieringskurvor beaktades när cykeltröskelvärdena (Ct) var mer än 40.

detektion av B. thuringiensis i spetsade livsmedelsprover

sallad (Lactucasativa), Kimbab och spenat (Spinaciaoleracea) köptes från en lokal marknad i Chuncheon, Korea., Proverna testades för frånvaro av målbakterier enligt ISO 7932 (2004). En alikvot av 50 g av varje typ av mat bereddes i en steril stomacher väska från Nasco Whirl-Pak belägen i WI, USA. Övernattning B. thuringiensis kulturer späddes i 0,5% pepton vatten och används för framställning av artificiellt förorenade prover med ympningsnivåer från 103 till 105 CFU/g (Chon et al., 2012; Kim et al., 2013). En alikvot på 1 mL av suspensionen av livsmedelsprover överfördes till ett nytt steriliserat rör och användes för DNA-extraktion.,

resultat och diskussion

detektering av B. thuringiensis med hjälp av cry2-genen

för de 120 stammarna erhölls förstärkningsprodukter på cirka 700 bp med hjälp av primers cry2 (Tabell 1). Som visas i Tabell 2 och Figur 1, när man använder PCR-inriktning cry2, 6 B. cereus stammar och 36 B. thuringiensis stammar (72%) förstärktes. Ingen annan B. cereus-grupp eller icke-B-grupp förstärktes. Detta visade en noggrannhet på 82% av cry2 för detektering av B. cereus-grupper. För de 120 testade stammarna gav 100 stammar NAs eller PAs, vilket indikerar en total noggrannhetsprocent på 83.,3% (Tilläggstabell 1). Medan Riojas et al. (2015) rapporterade en multiplex PCR av icke-ribosomal peptidsyntas (NRPS) gen och cry1 för att identifiera B. cereus och B. thuringiensis med en specificitet på 24,5% I B. cereus och 15% I B. thuringiensis.

det har rapporterats att B. thuringiensis-stammen kan syntetisera ett eller flera kristallproteiner eftersom en eller flera gener av kristalltoxin har hittats för B. thuringiensis. Den främsta orsaken till mångfalden av toxingener är överföringen av plasmider I B. thuringiensis (Adang et al., 2014). Det är en frekvent process för plasmidöverföringen genom antingen konjugering eller mobilisering (Makart et al., 2017)., Vidare genererar utbytet av gråtgener B. cereus med en ny bindning av gråt som leder till likheten mellan B. cereus och B. thuringiensis (Fiuza, 2015). Dessutom, med en annan isoleringskälla, visade gråtgenerna en skillnad i mångfald och fördelningar. Till exempel kan en ny cry gen hittas i varje livsmiljö som visar olika insekticid aktivitet.

detektering av B. thuringiensis med XRE-genen

potentiella kodningssekvenser (CDS) förutspåddes vara transkriptionella regulatorer., CD-skivor innehåller en helix-turn-helix (HTH) motiv i XRE-liknande protein familj och MerR familj transkriptionell tillsynsmyndigheter, tidigare motsvarande XRE gensekvenser i pBMB28 av B. thuringiensis YBT-020 och pCT281 av B. thuringiensis (GenBank: CP001910). CDS50, som är relaterade till HTH-typ transkriptionell regulator, SinR, var identisk med motsvarande element pG9842 av B. cereus G9842 (GenBank: CP001187). HTH-proteinerna, tillsammans med sigma-faktorer, deltar i ett brett spektrum av signalvägar, till exempel som förtryckare som hämmar sporulering (Murawska et al.,, 2014), biofilm formation (Colledge et al., 2011) och proteassekretion (Pflughoeft et al., 2011). Bortsett från Cry1Ab21 och δ-endotoxin kodad i toxinplasmid pIS56-63, som är ansvariga för konjugering och sporulering (Martínez-Núñez et al., 2010; deng m.fl., 2014) dessutom med 53 olika kodade putativa proteiner.

PCR-resultaten med XRE visade att ingen av 58 B. cereus eller non-B gav en förstärkning (Tabell 2 och figur 1). Totalt visade av 50 stammar av B. thuringiensis 47 positiva resultat (94%). Detta visade en noggrannhet på 97.,3% av XRE för detektering av B. thuringiensis bland de testade B. cereus-grupperna. För de 120 testade stammarna gav 117 stammar NAs eller PAs, vilket indikerar en total noggrannhetsprocent på 97,5% (Tilläggstabell 1).

standardkurva och Amplifieringseffektivitet

PCR-analysen i realtid utfördes med hjälp av DNA-extrakten från de rena kulturerna av B. thuringiensis-typstammen ATCC 10792 med inriktning på XRE-genen. Den utvecklade PCR-analysen i realtid var effektiv för att upptäcka koncentrationer från 2.6 × 10 till 2.6 × 106 CFU/reaction, som täckte 6 storleksordningar., Ekvationen för logkopiantal kontra Ct-värdet för B. thuringiensis var y = -3.853 x + 21.244 med ett R-kvadrerat värde på 0.993, vilket indikerar hög linearitet (Figur 2).