Integralmembranproteiner
Integralmembranproteiner (IMPs) fungerar som gateways till celler. Alla celler och organeller är inneslutna i ett ogenomträngligt lipidskikt och IMPs vi studerar är inbäddade i dessa membran. De är in-och utförselvägar för många joner, näringsämnen, avfallsprodukter, hormoner, droger och stora molekyler som proteiner och DNA. De är också ansvariga för mycket av kommunikationen mellan celler och deras miljö., Celler kan göra ett stort utbud av dessa proteiner, cirka 30% av generna i den mänskliga genomkoden för membranproteiner, och ändå vet vi relativt lite om dessa molekyler.
membranproteiner är tyvärr notoriskt svåra att hantera och studera eftersom de är utformade för att sitta i den hydrofoba miljön i lipidbilayern. De tenderar att vara instabila när de extraheras från sin inhemska miljö och vi måste lägga till tvättmedel för att täcka den hydrofoba ytan., För att förstå och kontrollera funktionen hos dessa proteiner är det viktigt att ha information om deras tredimensionella struktur, som vanligtvis erhålls genom röntgenkristallografi. Svårigheten att hantera dessa proteiner har dock gjort det svårt att lösa strukturerna, och hittills finns det färre än 300 strukturer av membranproteiner kända, mindre än 0,5% av alla kända strukturer. För högre eukaryoter är historien ännu mer stark, med endast 20 strukturer av mänskliga IMPs och mindre än 50 däggdjursimps löst., Membranproteiner är därför en av de viktigaste återstående gränserna för strukturbiologiforskning. På SGC tillämpar vi nu våra toppmoderna högkapacitetsmetoder för att övervinna flaskhalsarna i membranproteinforskning, så att vi på ett tillförlitligt sätt kan leverera rena membranproteinprover och strukturer av dessa fascinerande och medicinskt kritiska molekyler.
medicinsk betydelse
den medicinska betydelsen av denna enorma proteinfamilj kan inte överskattas., Mutationer i membranproteiner är involverade i många vanliga sjukdomar, inklusive hjärtsjukdomar, där funktionsstörningar i jonkanaler ofta är inblandade. Läkemedel riktade till kalciumkanaler kan kontrollera frågor som högt blodtryck och angina. Membranproteiner är involverade i cancer, där fel i signalvägar kan leda till att celler delar sig ur kontroll. Ofta överproduceras specifika membranproteiner i cancerceller och är därför mål för läkemedelsbehandling. Sjukdomar i hjärnan som migrän, depression och Alzheimers är alla kopplade till problem med transportörer och kanaler., Cystisk fibros orsakas av mutationer i cystisk fibros transmembrane conductance regulator (CFTR) gen som kodar för en kloridjonkanal.
eftersom många membranproteiner sitter vid cellens yta är de lätt tillgängliga för småmolekylära läkemedel som cirkulerar i blodet. Det är därför inte förvånande att över 50% av småmolekylära läkemedel binder till membranproteiner. G-proteinkopplade receptorer och kanaler är särskilt viktiga i detta avseende, men ABC-transportörer och lösningsbärare är också mål för läkemedelsbehandling., Vår förståelse för många andra sjukdomar, och vår förmåga att behandla dessa sjukdomar skulle dra stor nytta av mer strukturell och funktionell information om de proteiner som är inblandade. Vi hoppas att vi genom att lösa strukturerna för dessa proteiner, förstå den underliggande biokemi och interaktioner med substrat och hämmare, kan ge mer effektiva behandlingar för många sjukdomar.
SGC och integralmembranproteiner
SGC har lång erfarenhet av att lösa strukturer av lösliga humanproteiner med hjälp av högeffektiva system med hög genomströmning., Under de senaste två åren har vi anpassat dessa metoder för att lösa strukturer för humanmembranproteiner. Vi har screenat 186 humanmembranproteiner från olika familjer, valt en serie konstruktioner för varje protein, identifiera lämpliga rengöringsmedel för rening och sedan skala upp purificaiton och kristallisera dessa proteiner. Vi har kristalliserat 3 membranproteiner och löst vår första struktur, en process som tog mindre än två år från första klon till struktur.,
Vi har löst den första strukturen hos en mänsklig ABC-transportör, en klass av proteiner som är involverade i transport av små molekyler, Multi-läkemedelsresistens och sjukdomar som cystisk fibros och diabetes. Vårt första framgångsrika mål är den mänskliga mitokondriella ABC transporter, ABCB10, som är inbäddad i det inre membranet av mitokondrier. ABCB10 överuttrycks under erytroiddifferentiering, processen som bildar röda blodkroppar. det är överuttryckt i benmärg, hjärta och lever., Det finns nu bevis för att när abcb10 uttryck reduceras i Celler, de är mer mottagliga för oxidativ stress och att ABCB10 kan vara inblandade i att skydda hjärtat under en hjärtattack.
teknik för att studera IMPs
Vi utvecklar generiska metoder som möjliggör hög genomströmning bestämning av strukturer av humanmembranproteiner. Vi valde baculovirus / insect cell expression system som ger en lipidkomposition nära den hos mänskliga celler och är en beprövad hög genomströmning plattform., För varje målprotein genererar vi en serie konstruktioner av varierande längd och olika affinitetstaggar, inklusive genen Full längd och en serie trunkationer för att avlägsna potentiellt oordnade regioner. En hög genomströmning uttryck skärm används för att identifiera proteiner som kan användas för att rena milligram mängder IMPS för kristallisation. Varje protein renas initialt i dodecylmaltosid (DDM) tvättmedel och därefter screenas för stabilitet i en rad olika tvättmedel för att identifiera de optimala förutsättningarna för stabilitet och kristallisering.,
Vi har fastställt metoder för hög genomströmning nanodrop kristallisation och manipulation av bräckliga membranproteinkristaller. Vi har utvecklat effektiva system för screening av membranproteinkristaller för diffraktionskvalitet som en metod för kristallisationsoptimering. Vi har också optimerat vår datainsamling och analys av diffraktionsdata med hjälp av intensiva synkrotron microfocus beamlines, tillgängliga på resurser som Diamond Light Source Ltd, i Oxfordshire., Om möjligt kristallisering utförs med bundna ligander och hämmare för att fånga en enda infödd konformation och ge viktiga insikter i funktion och drogdesign. Vi planerar också att generera antikroppsfragment mot våra renade proteiner för användning som affinitetsreagens och kristalliseringshjälpmedel.
Lämna ett svar