Medium-chain-fettsyror minskar kolesterolhalten via minskning av intestinal gallsyror reabsorption i C57BL/6J möss

Djur och kost

– Hane C57BL/6 J möss (4 veckor gamla, n = 80) köptes från Institute of Laboratory Animal Science, Chinese Academy of Medical Sciences (Licens Nr. SCXK: JING2009-0007) och inrymt i ett temperaturstyrt rum (22 ± 2 °c, 40% till 60% fuktighet) med en 12-h ljus/mörk cykel., Djurens Skötsel och Användning Kommittén av den Kinesiska PLA Allmänna Sjukhus godkänt alla experimentella procedurer.

möss matades en basal diet (Ain-93G diet, köpt från Academy of Military Medical Science) under den första veckan för anpassning. Tio möss valdes slumpmässigt och matade en basal diet som den normala kontrollen, och de återstående mössen matades en kolesterolrik (CR) diet modifierad från Ain-96G-kosten. Blodprover samlades in från mandibular venös plexus två veckor senare., Möss med serum TC-nivåer som var 2 standardavvikelser större än den normala kontrollen (som stod för 67% av möss som matade CR-kosten) tilldelades slumpmässigt till tre grupper (n = 12 i varje grupp). Varje grupp matades en annan diet i 16 veckor (Tabell 1): kolesterolrik och medelkedjig triglycerid (CR-MCT), kolesterolrik och långkedjig triglycerid (CR-LCT) eller CR. Nisshin Oillio (Tokyo, Japan) donerade MCT (C8:0 och C10:0) och LCT (långkedjiga triglycerider, sojabönolja). Kolesterol köptes från Sigma-Aldrich (St.Louis, MO, USA)., Beijing Institute of Nutrition Resources (Peking, Kina) mätte fettsyrakompositionerna i CR-MCT-och CR-LCT-dieterna (Tabell 2). Kroppsvikt och matintag övervakades varje vecka.,

blod, ileum, galla och feces provtagning

fem möss valdes slumpmässigt från varje grupp efter 16 veckors utfodring för att registrera dietintag och feces utsöndring med separata metaboliska celler i 3 dagar., Feces frystorkades, vägdes, pulveriserades och lagrades vid − 80 °C för vidare analys. Alla möss fastades över natten (cirka 12 timmar) före blodprovsuppsamling från aorta ventralis under anestesi (xylazinhydroklorid). Serum samlades efter centrifugering av blodproverna. En mikrokapsel användes för att punktera gallblåsans vägg och extrahera gallan, och varje gallprov centrifugerades vid 16 000 g i 30 min. Supernatanten uppsamlades och förvarades vid-80 ° C., Ileumvävnader skars ut och sköljdes med iskall saltlösning, och portioner lagrades omedelbart vid-80 °C för vidare analys.

mätning av serumlipidprofiler

serum TC och triglycerid (TG) bestämdes i slutet av försöket med hjälp av kommersiella kit från Wako (Osaka, Japan). Högdensitetslipoprotein-kolesterol (HDL-C) och lågdensitetslipoprotein-kolesterol (LDL-C) mättes med hjälp av sedimentmetoder och ett kommersiellt kit från Abcam (Cambridge, UK). Serum totalt gallsyror (TBA) mättes med hjälp av ett kommersiellt kit från Blue Gene (Shanghai, Kina)., Alla tillverkarens instruktioner följdes strikt.

analys av gallsyror i feces och galla med HPLC-MS

metoderna för framställning och bestämning av gallsyror i feces och galla utfördes enligt vår tidigare studie och rapporter från Steiner et al. . En Shimadzu LC-20 AD högpresterande vätskekromatografi system (Shimadzu, Kyoto, Japan) kopplad till en tillämpad Biosystecm 3200 Q TRAP masspektrometer med en electrospray jonization (ESI) källa (tillämpad Biosystems, Carlsbad, USA) användes. HPLC-och MS-systemen kontrollerades med användning av analytiker 1, 4.,2 software. All chromatographic separations were performed using a Venusil AQ C18 column (2.5 μm, 50 mm × 2.1 mm) (Agela Techonologies, Delaware, USA). Cholic acid (CA), deoxycholic acid (DCA), chenodeoxycholic acid (CDCA), ursodeoxycholic acid (UDCA), lithocholic acid (LCA), taurocholic acid (TCA), taurodeoxycholic acid (TDCA), taurochenodeoxycholic acid (TCDCA), taurolithocholic acid (TLCA), glycocholic acid (GCA), glycodeoxycholic acid (GDCA) and glycochenodeoxycholic acid (GCDCA) were used as standard substances. Chloramphenicol was used as an internal standard., Ovannämnda material köptes från Sigma-Aldrich (St.Louis, MO, USA). Primära gallsyra, som CA, CDCA, TCA, TCDCA, GCA och GCDCA, och sekundära gallsyror, inklusive DCA, LCA, UDCA, TLCA, AVTALET och GDCA, i galla och avföring bestämdes genom att retentionstiderna.

kvantitativ realtids PCR (qRT-PCR)

prover från tunntarmen vävnad (cirka 100 mg) tvättades med iskalla PBS och homogeniserades. Totalt RNA från vävnader och celler isolerades med användning av Trizol reagens (Omega Bio-Tek, Norcross, USA, nr. R6812). Primers konstruerades med Primer Express 3.,0 programvara baserad på mRNA-sekvenserna från en databas (tabell 3) och syntetiserad av Invitrogen (Peking, Kina). Metoder för RNA-extraktion och kvantitativ realtids PCR (qRT-PCR) beskrivs i våra tidigare publikationer. qRT-PCR utfördes med hjälp av en Steg SYBR® PrimeScript® RT-PCR Kit (Takara Bioteknik Co., Ltd. Dalian, Kina). Amplifiering utfördes med användning av en BIO-RAD Icycler termisk cykler (BIO-RAD, Hercules, CA, USA). Relativa mRNA-uttrycksnivåer bestämdes med hjälp av metoden jämförande kritisk tröskel (Ct) (i ett separat rör)., Hushållning genen β-aktin användes som en kontroll för normalisering.

Western blot-analys

Western blot-analyser av tunntarmvävnad och odlade celler utfördes som beskrivits tidigare . Ekvivalenta mängder protein från varje prov framställdes och separerades med användning av SDS-PAGE (12% geler) följt av elektrotransfer till PVDF-membran., Membran inkuberades med blockeringslösning (Tris-buffrad saltlösning, 8% fettfri torrmjölk) i 2 timmar följt av inkubation med specifika antikroppar vid 4 °C över natten. Membran tvättades i stor utsträckning i TBST (Tris-buffrad saltlösning med Tween, innehållande 0,5% Tween-20 i TBS) och inkuberades med pepparrotperoxidas-konjugerade sekundära antikroppar i tbst för 1 h. membran tvättades vidare i TBST, och band detekterades med hjälp av kemiluminescensdetekteringsmedel. Blot densitometri utfördes, och banden analyserades med hjälp av ImageJ software., Antikroppar riktade mot den apikala natriumberoende gallsyratransportören (ASBT), ileal gallsyrabindande protein (i-BABP) och organisk lösningstransportör α/β (Osta/β) köptes från Abcam (Cambridge, UK). Sekundära antikroppar mot get IgG erhölls från Sun Biomedical Technology Co. (Peking, Kina).

immunofluorescens

ileumvävnad fixerad med 4% buffrad paraformaldehyd var inbäddad i paraffin och 4-µm tjocka sektioner framställdes. Sektioner deparaffiniserades och släcktes i 3% H2O2 för 15 min för att blockera endogent peroxidas., Sektioner tvättades i PBS och inkuberades med en anti-I-BABP-antikropp i PBS (1:50 utspädning) för 1 h vid 37 ° C. En FITC-konjugerad (fluoresceinisotiocyanat) antikropp tillsattes vid en 1: 50 utspädning och inkuberades för 0,5 h vid 37 ° C. sektioner tvättades och PI (propidiumjodid) användes för att fläcka kärnorna. I-BABP avbildades med ett fluorescensmikroskop (Bx60, Olympus, Ina, Japan). I-BABP observerades som grön fluorescens, och kärnan observerades som röd fluorescens .,

Caco-2 cellkultur

Caco-2-celllinjen erhölls från Cell Resource Center, Peking Union Medical College (som är huvudkontoret för den nationella infrastrukturen för Celllinjeresurs) på Sept. 20, 2016. PCR och kultur bekräftade att cellinjen kontrollerades fri från mykoplasmaförorening. Artens ursprung för dessa celler bekräftades med hjälp av PCR. Identiteten på celllinjen autentiserades med hjälp av STR-profilering (FBI, CODIS) . Alla resultat finns tillgängliga på webbplatsen (http://cellresource.cn)., Caco-2-celler odlades i dulbeccos modifierade Örnmedium (DMEM) innehållande 10% fetalt bovint serum (FBS), 1% penicillin-streptomycin och 1% icke-essentiella aminosyror. Caco-2 celler bibehölls vid 37 °C i en fuktig atmosfär som innehåller 5% CO2 och 95% luft. Mediet ändrades varannan dag. DMEM, FBS, 1% icke-essentiella aminosyror och andra material köptes från den nationella infrastrukturen för Celllinjeresurs (Peking, Kina) eller Sigma-Aldrich (St.Louis, MO, USA).,

kaprylsyrapermeabilitetsanalys genom Caco-2-cellmonolayers

för gallsyrareabsorptionsexperiment, med hänvisning till rapporten från Y. Wang, et al. , celler såddes och odlades på Millicell hängande Cellkulturinsatser (0.4 µm, Millipore, Molsheim, Frankrike) i 21 dagar för att erhålla sammanflödet och mycket differentierade cellmonolayers. Bildandet av funktionella epitelmonolayers övervakades genom mätning av det transepiteliala elektriska motståndet (TEER) med hjälp av en Millicell-ERS-mätare (Millipore) före experiment., Cellulär morfologi observerades med användning av ett elektronmikroskop, och permeabiliteten bestämdes med Lucifer gul (Sigma, MO, USA) som en markör.

beredningen av fettsyror och CA utfördes enligt beskrivningen av X. Zhang, et al. . Fettsyror och CA mättes och löstes i etanol och späddes sedan med cellodlingsmedium innehållande 20 mg / l endotoxinfri BSA till en slutlig koncentration av 50, 100 eller 200 µmol/l (etanol< 0.1%). De upplösta fettsyrorna och CA inkuberades i ett vattenbad vid 37 ° C under 1 h innan de tillsattes till cellerna., Kaprylsyra (C8:0), kaprinsyra (C10:0), stearinsyra (C18:0) och oljesyra (C18: 1) köptes från Sigma-Aldrich (St.Louis, MO, USA).

apikala (AP) och basolaterala (BL) sidor av monolagret tvättades med Hank ’ s Balanced Salt Solution (HBSS) och jämvikt i serumfritt komplett medium för 15 min. Mediet i AP ersattes med färskt medelhaltigt CA (200 µmol/L) eller blandat med en av fettsyrorna (C8:0, C10:0, C18:0 eller C18:1) vid 50, 100 eller 200 µmol / L., Cellviabiliteten hos Caco – 2-celler under olika förhållanden bedömdes genom WST-1-cellens cytotoxicitetsanalys (Fig. 1). Mediet med en av fettsyrorna definierades som”C8:0, C10:0, C18:0 eller C18:1-gruppen”. ”Kontrollgruppen” innehöll inga fettsyror, och ”blank grupp” saknade CA och fettsyror. Endast färskt medium användes i BL. Medierna från AP-och BL-sidorna togs bort 2 h senare och lagrades för analyser av CA med HPLC-MS., Den uppenbara permeabiliteten (Papp) beräknades med följande ekvation: Papp = DQ/DT× 1/C0A (DQ är det sammansatta utseendet i mottagarfacket, dt är tiden, C0 är koncentrationen i givarfacket och A är insatsens yta).

i-BABP expressionsnivåer i Caco-2-celler

Caco-2-celler frös till en 6-well platta (Corning, NY, USA) och odlades till total sammanflöde med hög differentiering för att bekräfta effekterna av MCFA på i-BABP . Odlingsmediet ersattes före experiment med medium innehållande delipidized FBS för 24 h., Cellerna tvättades med iskall fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och inkuberades med färskt medium innehållande ca 200 µmol/l (definierat som CA-grupp) eller CA blandat med en av fettsyrorna (C8:0, C10:0, C18:0 eller C18:1) vid 200 µmol/l (definierat som ”C8:0+CA, C10:0+CA, C18:0+CA eller C18:1+ca-grupp”) eller C8:0 eller C10:0 vid 200 µmol/L utan ca (definierad som ”C8:0 grupp och C10:0 grupp”) för 24 h. och den tomma gruppen var utan fettsyror och ca. Mediet avlägsnades och cellerna tvättades tre gånger med iskalla PBS., Totalt RNA och protein isolerades och samlades in för ytterligare analyser av mRNA i-BABP och proteinuttryck.

statistisk analys

Alla data uttrycks som medelvärdet ± SD. Data analyserades med hjälp av envägsanalys av varians följt av det oberoende T-testet för att bestämma betydelsen av skillnaden mellan grupper som använder SPSS-programversion 17.0. P< 0,05 ansågs statistiskt signifikant.