utvecklingen av djuphavs Gulper Eel mitokondriella genom: storskaliga Genomarrangemang har sitt ursprung inom Ålen

Abstrakt

nyligen genomförda studier har visat att avvikelser från den typiska mitokondriella genordningen på ryggradsdjur är vanligare än vad man ursprungligen trodde., Sådana avvikelser är emellertid mindre, med inversioner och / eller translokationer av några gener som är involverade och tandemduplicering av genregionerna följt av deletioner av gener som har åberopats som mekanismer som härrör från en sådan ny genordning., Under kursen i molekylär fylogenetiska studier på Elopomorpha (ål och deras allierade), fann vi att mitokondriella genomet (mitogenomes) från två djupa hav gulper ål, Eurypharynx pelecanoides (Eurypharyngidae) och Saccopharynx lavenbergi (Saccopharyngidae), uppvisar en identisk gen ordning som i hög grad skiljer sig från alla andra ryggradsdjur. Fylogenetisk analys med hjälp av mitogenomiska data från 59 fiskarter bekräftade inte bara ett enda ursprung av en sådan genordning med tillförsikt utan visade också att den hade härletts från den typiska ryggradsdjur-genordningen., Detaljerade jämförelser av gulper eel-genordningen med den hos typiska ryggradsdjur föreslog att förekomsten av ett enda steg, storskalig duplicering av genregion som sträcker sig > 12 kb, följt av deletioner av gener i en gemensam förfader till de två arterna, står mest parsimoniously för detta ovanliga genarrangemang.

introduktion

mitokondriell genordning på ryggradsdjur ansågs initialt konservativ eftersom de fullständiga nukleotidsekvenserna av mitokondriella genom (mitogenomer) från däggdjur (Anderson et al. 1981, 1982; Bibb et al., 1981) och den afrikanska clawed grodan (Roe et al. 1985) visade en gemensam genordning. Eftersom de fullständiga mitokondriella DNA-sekvenserna (mtDNA) har bestämts för ett antal ryggradsdjur (269 arter per den 11 juni 2003; National Center for Biotechnology Information web site: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PMGifs/Genomes/7742.html), har det insett att avvikelser från den typiska genordningen inte är så sällsynta hos ryggradsdjur (fig. 1; Boore 1999). Med undantag för placenta däggdjur, exempel inkluderar alla större lineages av ryggradsdjur som lampreys (Lee och Kocher 1995), amfibier (Macey et al. 1997, Sumida m.fl., 2001), reptiler (Kumazawa och Nishida 1995; Quinn och Mindell 1996; Macey et al. 1997), fåglar (Desjardins och Morais 1990, 1991; Quinn och Wilson 1993; Mindell, Sörenson, och Dimcheff 1998), ottawa (Pääbo et al. 1991; Janke m.fl. 1994) och fisk (Miya och Nishida 1999; Inoue m.fl. 2001b; Miya, Kawaguchi, och Nishida 2001). Sådana genarrangemang är dock lokala (framför allt inom ett kluster av tRNA-gener), och inget exempel har hittats som involverar genomskaliga omarrangemang.,

Gulper eels är välkända djuphavsdjur, kollektivt inklusive fyra familjer placerade i ordningen Saccopharyngiformes, som förekommer på bathypelagiska djup (>1,000 m) över hela världens oceaner (Bertelsen, Nielsen och Smith 1989). Deras bisarra utseende (fig. 1), som är resultatet av extremt förstorade, deformerade gapar vid spetsen av ål orm-liknande huvud och kropp, har väckt stor uppmärksamhet från många forskare (t.ex. Bertelsen, Nielsen och Smith 1989; Robins 1989)., Sådana specialiserade anatomiska egenskaper har lett utredare att anta att de fylogenetiska positionerna hos dessa djur ligger utanför benfisken (t.ex. Tchernavin 1946), även om de i allmänhet har ansetts vara nära släktingar till de sanna ålen (order Anguilliformes), eftersom de har ett lövliknande leptocephalöst larvstadium (Greenwood et al. 1966; Inoue och Miya 2001).,

under molekylära fylogenetiska studier av elopomorfa (ål och deras allierade) med hjälp av mitogenomiska data fann vi en ovanlig mitokondriell genordning för en av gulper ålen, Eurypharynx pelecanoides (fig. 1). Denna artikel beskriver ny gen organisation i mitogenomes av två arter av gulper ål, E. pelecanoides och Saccopharynx lavenbergi. Vi använde en polymeraskedjereaktion (PCR)-baserad strategi som utvecklats av Miya och Nishida (1999) för sekvensering av de fullständiga mitogenomerna av dessa fiskar., För att utforska ursprunget till sådana unika mitogenomer utsatte vi mitogenomiska data för fylogenetisk analys, och vi diskuterar här de möjliga mekanismerna som genererar ett sådant genarrangemang i de två gulper ålen.

material och metoder

prover

mitokondriella DNA-sekvenser erhölls från sex individer från två arter som representerar två familjer i ordningen Saccopharyngiformes (Robins 1989). För den monotypiska familjen Eurypharyngidae, en individ av E., pelecanoides användes som prov för bestämning av den fullständiga mtDNA-sekvensen, och de andra fyra individerna, inklusive två leptocefalösa larver, användes för bestämning av partiella sekvenser av fyra stora genkorsningar (fig. 2) för att bekräfta genordningen i E. pelecanoides mitogenome. För familjen Saccopharyngidae användes en enda individ av S. lavenbergi som prov för bestämning av den fullständiga mtDNA-sekvensen., Kupong prover förvarades i fisk samlingarna vid naturhistoriska Museet & Institute, Chiba, Japan (CBM-ZF), och vid University of Washington (UW): E. pelecanoides (CBM-ZF 10311: Hyuga-Nada, södra Japan, CBM-ZF 10312, 10313, 10316, och 10317: equatorial centrala Stilla Havet) och S. lavenbergi (UW 045633: Östra Stilla havet).

DNA-extraktion

en del av den epaxiella muskulaturen (ca. 0,25 g) skars ut från färska exemplar av varje art och omedelbart bevarades i 99,5% etanol., Totalt genomiskt DNA extraherades med Qiagen QIAamp vävnadssats enligt tillverkarens protokoll.

polymeraskedjereaktion och sekvensering

hela mitogenomen av två gulper ål förstärktes med hjälp av en lång PCR-teknik (Cheng, Higuchi och Stoneking 1994). Fem fiskar-universella och tre artspecifika lång-PCR-primrar (s-LA-16S-l + H12293-Leu och l12321-Leu + s-la-16S-H för E. pelecanoides; l2508-16S + sala-ND4-h och Sala-CO1-l + Sala-ND1-H för S. lavenbergi; fig. 1) användes för att förstärka hela mitogenomen av varje ål i två reaktioner., Hela mitogenomes av de andra fyra E. pelecanoides personer som var förstärkt med tre fiskar-universal primers och en artspecifik lång-PCR-primer (L2508–16S + Eupe-ND2-H och L12321-Leu + S-LA-16-H). Fyra artspecifika primrar (Eupe-ND2-H för E. pelecanoides; sala-CO1-l, sala-ND1-h och Sala-ND4-H för S. lavenbergi) utformades alternativt med hänvisning till de partiella nukleotidsekvenserna från ND2-genen av E. pelecanoides och Coi, ND1 och ND4-generna av S. lavenbergi bestämda från varje totalt DNA med hjälp av Fish-universal primers.,

lång-PCR-produkterna späddes med TE-buffert (1: 20) för senare användning som PCR-mallar, med undantag för en region mellan de två lång-PCR-primrarna (mellan S-La-16S-h och S-La-16S-l och H12293-Leu och L12321-Leu för E. pelecanoides; fig. 1), där totalt genomiskt DNA användes alternativt.

totalt 82 fisk-universal-primers (Miya och Nishida 1999, 2000; Inoue et al., 2000, 2001a, 2001b, 2001c, 2001d; Ishiguro, Miya och Nishida 2001; Kawaguchi, Miya och Nishida 2001) användes i olika kombinationer för att förstärka sammanhängande överlappande segment av hela mitogenomen för var och en av de två arterna. Artspecifika primrar utformades i fall där inga lämpliga fisk-universella primrar fanns tillgängliga. En förteckning över PCR-primrar som används för en viss art finns tillgänglig från J. G. I. på begäran. Lång-PCR och efterföljande PCR-reaktioner utfördes som tidigare beskrivits (t.ex. Miya och Nishida 1999; Inoue et al. 2003).,

dubbelsträngade PCR-produkter, renade med hjälp av ett FÖRSEKVENSERINGSSATS (USB), användes därefter för direkt cykelsekvensering med användning av färgmärkta terminatorer (tillämpade Biosystems). De primers som användes var desamma som för PCR. Alla sekvenseringsreaktioner utfördes enligt tillverkarens instruktioner. Märkta fragment analyserades med hjälp av en modell 377 DNA-sequencer (tillämpad Biosystems).

sekvensanalys

DNA-sekvenser analyserades med hjälp av datorprogramvaran dnasis version 3.2 (Hitachi Software Engineering)., Placeringen av de 13 proteinkodande generna bestämdes genom jämförelser av DNA-eller aminosyrasekvenser av benfiskmitogenomer. De 22 tRNA-generna identifierades av deras cloverleaf sekundära strukturer (Kumazawa och Nishida 1993) och anticodonsekvenser. De två rRNA-generna identifierades genom sekvens likhet och sekundär struktur (Gutell, Gray och Schnare 1993). Sequence-data är tillgängliga från DDBJ/EMBL/GenBank med anslutning nummer AB046473 och AB046475–AB046490 för E. pelecanoides, och AB047825 för S. lavenbergi.,

fylogenetisk analys

datamatriserna från Inoue et al. (2001d) och Miya, Kawaguchi och Nishida (2001) kombinerades och överflödiga taxa eliminerades. Mitogenomic sekvenser från de två gulper ål och två teleosts (Gymnothorax kidako, AP002976 och Salmo salar, U12143 ) tillkommit. Eftersom entydiga anpassningar av de två rRNA-generna på grundval av sekundära strukturmodeller inte var genomförbara (Miya och Nishida 2000) användes de inte i analyserna., ND6-genen användes inte i de fylogenetiska analyserna på grund av dess heterogena bassammansättning och konsekvent dålig fylogenetisk prestanda (t.ex. Zardoya och Meyer 1996; Miya och Nishida 2000). Även tRNA loops, tRNASer(AGY) (instabila härledda sekundära strukturer i vissa arter) och andra tvetydigt inriktade regioner, såsom 5′ och 3′ ändarna av flera proteinkodande gener, utesluts bilda analyserna., Dessutom uteslöts 3: e kodonpositioner i de proteinkodande generna som positivt kunde vilseleda en analys av högre nivårelationer av aktinopterygianer (Miya och Nishida 2000) från analyserna, vilket lämnade 7,984 tillgängliga nukleotidpositioner från de 12 proteinkodande generna och 21 tRNA-generna.

bayesiska fylogenetiska analyser utfördes med användning av mrbayes 2.01 (Huelsenbeck och Ronquist 2001)., Den allmänna tidsreversibla modellen med vissa platser som antas vara oföränderliga och med variabla platser som antas följa en diskret gammafördelning (GTR + I + Γ; Yang 1994) valdes som den bäst lämpade modellen för nukleotid substitution (Modelltest version 3.06; Posada och Crandall 1998). Vi ställer in maximala sannolikhetsparametrar i MrBayes enligt följande: ”LSet nst = 6″ (GTR),” rates = invgamma ”(I + Γ) och” basefreq = estimate ” (beräknad andel av bastyper från data). Markovkedjan Monte Carlo-processen sattes så att fyra kedjor (tre uppvärmda och en kalla) sprang samtidigt., Vi genomförde två oberoende körningar i 1 miljon generationer, med träd som samplades varje 100 generationer, som var och en började från ett slumpmässigt träd. Två oberoende analyser konvergerade på liknande log-likelihood-poäng och nådde ”stationarity” (brist på förbättring av ML-poäng) senast 120 000 generationer., Således kasserades de första 1,200 träden från varje analys, och de återstående 17 602 kombinerade proverna från två oberoende analyser användes för att generera ett 50% majoritetsregelkonsensussträd, med andelen prover som återhämtade någon särskild clade som representerar clades bakre Sannolikhet (Huelsenbeck och Ronquist 2001).

resultat

Genomorganisationer

de totala längderna för E. pelecanoides och S. lavenbergi mitogenomes är 18,978 bp och 18,495 bp (förutom en del av det putativa kontrollområdet för S., lavenbergi), respektive (se Kompletterande Material online). Genominnehållet i dessa två gulper ål innefattar två rRNA, 22 tRNA och 13 proteinkodande gener, som finns i andra ryggradsdjur (fig. 2). Också som i andra ryggradsdjur kodas de flesta gener av dessa två arter på H-strängen, förutom ND6-och åtta tRNA-generna. Alla egenskaper är lika långa som i andra Benfiskar med undantag för COI-genen och kontrollområdet för E. pelecanoides och Coi och cyt b-generna för S., lavenbergi (ca 100, 800, 150 och 30 bp längre än de i andra beniga fiskar, respektive).

E. pelecanoides mitogenome innehåller tre noncoding regioner längre än 200 bp (fig. 2; Se även kompletterande material online; icke-kodningsregion och kontrollregion ). Den nc1, som ligger mellan tRNASer(UCN) och tRNAAsp gener, och nc2, som ligger mellan tRNAAsp och COII gener, innehåller två och fyra kallade pseudogener som motsvarar urartar kopior av tRNAAsp gen, respektive., En icke-kodande region (1,818 bp) belägen mellan generna cyt b och tRNAPhe verkar motsvara kontrollområdet. S. lavenbergi mitogenome innehåller också tre icke-kodande regioner längre än 200 bp (icke-kodande region och kontrollregioner ). Nc, som ligger mellan generna tRNALeu(CUN) och ND5, innehåller minst två pseudogener som motsvarar degenererande kopior av tRNALeu-genen(CUN)., CR1 (992 bp), som ligger mellan två tRNA gene clusters (TP och IM-regioner), och CR2 (> 837 bp), som ligger mellan cyt b och tRNAPhe gener som tycks motsvara den kontroll regionen, och de har helt identiska sekvenser över 800 bp, vilket tyder på att de genomgår samordnade utvecklingen (se Kumazawa et al. 1998).

med undantag för de två duplicerade kontrollregionerna (CR1 och CR2) i S. lavenbergi mitogenomen uppvisar mitogenomerna från de två djuphavsgulperna en identisk genordning (fig. 2)., Den mitokondriella genordningen för de två gulpereelerna skiljer sig emellertid mycket från den hos alla andra ryggradsdjur som hittills är kända. När vissa tRNA-gener uteslöts från jämförelserna (fig. 2), har vi identifierat fem gen block A, tRNAGlu–tRNAGln, B, ATP8-ND3, C, tRNALeu(CUN)–ND6, D, tRNAIle–tRNALys; och E, tRNAArg–tRNASer(AGY) gen-regioner), gen order som är identisk med den som typiska ryggradsdjur.,

fylogenetiska positioner av två Gulper ål

Figur 3 är ett 50% majoritetsregelkonsensusträd av de 17 602 kombinerade proverna från två oberoende bayesiska analyser av 59 mitokondriella nukleotidsekvenser från de konkatenerade 12 proteinkodning (Inga 3: e kodonpositioner), plus 21 tRNA-gener (endast stamregioner) med hjälp av GTR + I + Γ-modellen för sekvensutveckling (Yang 1994). Med undantag för några noder inom Neoteleostei stöddes de flesta interna grenar av höga bayesiska bakre sannolikheter (≥95%)., Det bör noteras att det resulterande trädet uttryckligen visar inte bara att de två gulper ålen bildar ett systergruppsförhållande med en hög posterior Sannolikhet (100%), men också att de är djupt kapslade inom Anguilliformes (sanna ålar), vilket starkt tyder på att de har härletts från en ål-liknande förfader.

diskussion

nyligen har mer än 140 kompletta mtDNA-sekvenser från actinopterygiska fiskar bestämts (t.ex. Miya och Nishida 1999, 2000; Inoue et al., 2000, 2001a, 2001b, 2001c, 2001d, 2003; Ishiguro, Miya och Nishida 2001, 2003; Kawaguchi, Miya och Nishida 2001; Miya, Kawaguchi och Nishida 2001; Miya et al. 2003; Saitoh et al. 2003), och flera exempel på genrearrangemang har rapporterats (fig. 1). Det bör noteras att sådana genomläggning händelser involverar få gener och att genarrangemanget av gulper ål mitogenom skiljer sig mycket från andra ryggradsdjur.,

fylogenetiska konsekvenser på ursprunget till ny Genordning

för att härleda utvecklingen av genarrangemangen i de två gulper ålen krävs inferens för den förfäders organisationen baserad på en tillförlitlig fylogenetisk ram. Även om gulperenål har inkluderats i Elopomorfa baserat enbart på en distinkt pelagisk larvform, kallad leptocephalus, har ingen bekräftat sin fylogenetiska position med hjälp av karaktärsmatriser som härrör från morfologiska eller molekylära data (Inoue och Miya 2001).,

Bayesiansk analys med hjälp av mitogenomiska data från 59 arter som till fullo representerar teleosteansk fiskmångfald (fig. 3) inte bara bekräftade att den nya genordning av de två gulper ål har sitt ursprung i en gemensam förfader till de två arterna, men också visat att deras ursprung var oberoende av de andra nya gen order. Det verkar också som om den nya genordningen av Conger myriaster, en annan medlem av elopomorpha, har ett ursprung som är oberoende av gulper ål., Det bör noteras att Anguilla japonica, som har den typiska ryggradsdjur genen ordning, tryggt placerades som en syster arter av de två gulper ål. Den mest parsimonious rekonstruktion av genen omarrangemang händelser på fylogenetiska trädet indikerade att avvikande genordning av de två gulper ål härrör från den typiska ryggradsdjur.

möjlig mekanism för omläggning av genen i Gulper ål

två huvudmekanismer har föreslagits för att förklara genen i ryggradsdjur mitogenom (Lee och Kocher 1995; Kumazawa et al. 1996)., En är tandemduplicering av genregioner som ett resultat av halkade strand mispairing, följt av deletioner av gener (Moritz och Brown 1986; Levinson och Gutman 1987). Även om dynamiken i mitokondriella genarrangemang inte har förklarats hos vissa ryggradslösa djur (t.ex. Kurabayashi och Ueshima 2000; Machida et al. 2002, Tomita m.fl. 2002), ryggradsdjur mitokondriella genen omorganiseringar kan förklaras av en sådan mekanism (Desjardins och Morais 1990; Quinn och Wilson 1993; Kumazawa och Nishida 1995; Kumazawa et al., 1996; Mindell, Sörenson, och Dimcheff 1998; Miya och Nishida 1999; Inoue et al. 2001b), och dess genomförbarhet stöds också av de frekventa polymorfa dupliceringarna av mtDNA-sekvenser (t.ex. Stanton et al. 1994; Gach och Brown, 1997; Mindell, Sörenson, och Dimcheff 1998; Miya och Nishida 1999). De andra föreslagna mekanismerna åberopar olaglig priming av replikering av tRNAs och den resulterande integrationen av tRNA-gener runt kontrollområdet (Cantatore et al. 1987; Jacobs m.fl. 1989).,

Även om den andra modellen inte är utesluten vid denna tidpunkt, gynnas den första modellen som mekanismen för genomläggning i gulper ål mitogenomerna. Förutsatt att ett långt DNA-fragment i tRNAIle–CR-regionen i den typiska organisationen dupliceras (fig. 4), efterföljande deletioner av överflödiga gener skulle ge upphov till den omarrangerade genorganisationen i gulper ål. En sådan tandemduplicering och efterföljande deletioner resulterade mest parsimoniously i den observerade genordningen och associerade intergena distanser i dessa två gulper ål.,

flera deletioner av överflödiga gener verkade vara ofullständiga i de två gulper ålen, på grund av flera sträckor av icke-kodande sekvenser (fig. 2) förekommer runt de gener som är involverade i omläggningen (fig. 4). Även om nc1 och nc2 i E. pelecanoides och nc i S. lavenbergi består av repetitiva kallade pseudogener som motsvarar urartar kopior av intilliggande tRNA-genen, CR1 och CR2 i S. lavenbergi mitogenome har identiska sekvenser över 800 bp, och CR1 är beläget på den förmodade dupliceras position medan CR2 ligger på den ursprungliga positionen av kontroll regionen., Denna observation i S. lavenbergi mitogenome stöder konceptet av tandem dubbelarbete och efterföljande borttagning händelser som har ägt rum i tRNAIle–CR-regionen (fig. 4).

om fyra av fem sammanhängande genblock duplicerades tillsammans i en gemensam förfader till de två arterna, och om efterföljande radering av gener inträffade före specieringen, förlängdes de antagna duplicerade delarna av gulper ål, allt från trnailgenen till CR av den typiska organisationen, utöver 12 kb (fig. 1)., Före denna studie var de förmodade duplicerade regionerna av ständigt kända ryggradsdjur-omarrangemang i bästa fall 4 kb. Dessutom begränsades alla kända tandemly upprepade kodningssekvenser till regioner som gränsar till CR, IQM eller WANCY-regionerna, vilket eventuellt återspeglade tillfällig, otydlig uppsägning av replikationer utanför deras ursprung. Den duplicerade regionen i gulper ål mitogenom var mycket större än den för någonsin kända ryggradsdjur omarrangemang och involverade nästan hela mitogenom (fig. 1).

Vi tackar kaptenerna, officerarna, besättningen, forskarna och eleverna ombord under kt97-10 kryssningen<– –> av R/V Tansei Maru och KH00-1 kryssningen av R/V Hakuho Maru för deras hjälp vid insamling av prover. Denna studie kunde inte ha varit möjlig utan den generösa donationen av S. lavenbergi vävnadsmaterial, som vi uppriktigt tackar E. O. Wiley. Vi tackar också två anonyma granskare för deras värdefulla kommentarer på manuskriptet. Tack beror också på Y., Fukuyo, K. Furuya, K. Nanba, och doktorander vid Fisheries Oceanography Laboratory, University of Tokyo, för generöst tillåter oss att använda sina experimentella anläggningar, och Marshall Editions Ltd.; Andromeda Oxford Ltd.; och Tokai University Press för tillstånd att använda illustrationer och fotografier. K. Pearson lämnade vänligen relevant information om ”S. lavenbergi” – exemplarets identitet. Denna studie stöddes delvis av bidrag i stöd från Ministeriet för Utbildning, Vetenskap och kultur i Japan (nr., 09740644, 10460081, 10660189, 11640705, 11691177, 12460083, och 12NP0201) och ”Forskning för Framtiden” Program Nr. JSP-RFTF 97L00901 från Japan Society for the Promotion of Science. K. T. var stöds av Research Foundation från Touwa Shokuhin Shinkoukai och Ål Research Foundation från Nobori-kai.

citerad litteratur