Epilation induziert Haar-und Hautpigmentierung durch eine EDN3/EDNRB-abhängige regenerative Reaktion von Melanozytenstammzellen

Epilation induziert Haar-und Hauthyperpigmentierung bei C57BL/6J-Mäusen

Im Allgemeinen zeigen Haarfollikel auf der dorsalen Haut von Mäusen einen synchronisierten ersten Haarzyklu15., Die Haarfollikel auf der gesamten dorsalen Haut sind typischerweise in Anagen vom postnatalen Tag 1-12, in Catagen vom Tag 16-19 und in Telogen danach bis zum nächsten Anagen11, 22, 23. Um Hautpigmentierungsveränderungen während des postnatalen Haarzyklus zu visualisieren, haben wir die dorsalen Rumpf-und Kopfregionen von C57BL/6J-Mäusen am postnatalen Tag 11 (P11) (Anagen-VI-Stadium im ersten Haarzyklus), P21 (Telogenstadium) bzw. Wie in Abb. 1A war die gesamte Haut bei P11 homogen schwarz und bei P21 homogen rosa., Interessanterweise war die Kopfhaut bei P30 jedoch immer noch rosa, während die Rückenhaut schwarz war (Abb. 1A). Diese Daten zeigen, dass, obwohl MSCs in Kopfhauthaarfollikeln während des ersten Haarzyklus in reife Melanozyten differenzieren, sie nicht aktiviert werden, um Melanozyten zu einem Zeitpunkt zu regenerieren, zu dem sich die Haarfollikel bereits im Anagen des zweiten Haarzyklus befinden. Wir haben daher getestet, ob Epilation McSCs in der Kopfhaut zu diesem Zeitpunkt aktivieren könnte., Diese Epilationsbehandlung induzierte signifikant die Expression von Entzündungsfaktoren, aber ihr Niveau ist viel niedriger als das durch Wundverletzungen induzierte, was darauf hindeutet, dass die Epilation nur eine leichte Form der Hautverletzung induziert (Abb. S1). Interessanterweise war die Pigmentierung der Kopfhaut bereits 7 Tage später bei P28 signifikant erhöht (6,06 ± 1,5-fach, n = 9), wenn Kopfhauthaare von C57BL/6J-Mäusen bei P21 epiliert wurden (wie bereits im Telogenstadium des ersten Haarzyklus erwähnt) (Abb. S2A, B) und der Epilationsbereich erzeugte eine pigmentierte Insel (Abb. 1B)., Entsprechend waren die epilationsinduzierten regenerierenden Haare hyperpigmentiert (2,68 ± 0,87-fach, n = 5) im Vergleich zu Haaren nicht epilierter Kontrollen (Abb. 1C,D). Diese Ergebnisse zeigen, dass Epilation in der Kopfhaut vorzeitige Hautrepigmentierung und Haarhyperpigmentierung hervorrufen kann.

Weil sich Haare auf der Rückseite von C57BL/6J-Mäusen während des ersten postnatalen Haarzyklus physiologisch regenerieren (Abb. 1A), fragten wir uns auch, ob Epilation Veränderungen in der Haarregeneration auf dem Rücken hervorrufen würde. Tatsächlich war der epilierte Bereich 7 Tage nach der Epilation bei P21 im Vergleich zum nicht epilierten Bereich hyperpigmentiert (Abb. S2C, D), ebenso wie die einzelnen regenerierten Haare (Abb. S2E)., Diese Daten legen nahe, dass die epilationsinduzierte Hyperpigmentierung nicht auf die Kopfhaut beschränkt ist. Angesichts dieser Beobachtungen fragten wir auch, ob die Auswirkungen der epilationsinduzierten Hyperpigmentierung bei alten Mäusen noch funktionieren würden. Interessanterweise wurden die regenerierenden Haare im Rücken von 1,5 Jahre alten Mäusen 30 Tage nach der Epilation signifikant hyperpigmentiert (1,07 ± 0,08-fach, n = 3), verglichen mit den nicht epilierten, ruhenden Haaren (0,84 ± 0,03) (Abb. 1E,F). Darüber hinaus zeigte die HPLC-Analyse, dass die Epilation die Eumelaninsynthese (1,79 ± 0,09%, n = 3) anstelle der Pheomelaninsynthese (0,97 ± 0) induziert.,12 falte, n = 3) in Rückenhaaren (Abb. S3). Dies deutet darauf hin, dass die Epilation die Aktivierung von MSCs induziert, um entweder reifere Melanozyten zu erzeugen, oder sie erhöht die Melaninsynthese in reifen Melanozyten in Haarzwiebeln gealterter Mäuse.

Epilation-Verletzung stimuliert McSC-Proliferation und induziert Erzeugung von dermalen und epidermalen Melanozyten und Expression von Melanogenese-verwandten Genen

Da Melanogenese an anagen24 gekoppelt ist, untersuchten wir, ob Epilation-induzierte Pigmentierung in der Kopfhaut durch Anageninduktion verursacht wird. Wie in Abb., 2A begannen die epilationsinduzierten Haarfollikel sofort mit dem Anagen, während bei nicht epilierten Kontrollmäusen die Haarfollikel für einen längeren Zeitraum bei Telogen blieben. Daher reagierte der ruhende Haarfollikel McSCs auf die Epilation, indem er aktiviert wurde. Sieben Tage nach der Epilation wurden pigmentierte Melanozyten nicht nur in reifen Haarzwiebeln, sondern auch in der Dermis, den Öffnungen der Haarfollikel und der interfollikulären Epidermis beobachtet (Abb. 2A)., Entsprechend wurden melanozytenspezifische Marker wie PMEL17 und TYR in den epilationsinduzierten pigmentierten Regionen, jedoch nicht in Kontrollhaarfollikeln nachgewiesen (Abb. S4A). Darüber hinaus zeigten Western-Blot-Daten, dass die Spiegel der melanogenesebezogenen Proteine TYRP1 (4,22 ± 0,96-fach, n = 6) und TYR (9,75 ± 2,76-fach, n = 6) beide durch Epilation signifikant erhöht waren (Abb. S4B und S9). Die Ergebnisse legen nahe, dass die Epilation nicht nur MSCs aktiviert, sondern auch die Regeneration von Melanozyten induziert, um interfollikuläre Bereiche zu bevölkern.,

7 Tage nach der Epilation bei P21 war die Gesamtmelanozytenzahl in jeder Haarzwiebel (20 ± 1, 9) signifikant erhöht im Vergleich zur physiologischen Regeneration (15, 7 ± 1, 4) (Abb. 2B)., Entsprechend gab es auch mehr Melanosomen in den epilationsinduzierten regenerierten Haarzwiebeln als in physiologisch regenerierten Haarzwiebeln (Abb. 2C und Abb. S4C,D). Diese Daten legen nahe, dass die Epilation während des ersten postnatalen Haarzyklus eine McSC-Hyperproliferation induzierte. Tatsächlich war die Proliferationsrate der MSCs 3 Tage nach der Epilation höher (86,2 ± 3,5% der Zellen waren nach der Epilation Ki67-positiv, verglichen mit 45,6 ± 3,4% der Zellen, die bei Kontrollen Ki67-positiv waren) (Abb. 2D)., Interessanterweise wurden KIT-positive Zellen nicht in der Epidermis gefunden, aber sie existierten 1 Tag nach der Epilation in der Haarwölbung und waren 3 Tage nach der Epilation deutlich in der Epidermis vorhanden (Abb. 2E und Abb. S5). Die Anzahl der Kit + – Zellen in der epilierten Epidermis (2,32 ± 0,72/Abschnitt, n = 4) ist im Vergleich zur physiologischen Epidermis (0,77 ± 0,68/Abschnitt, n = 4) signifikant erhöht (Abb. 2F). Entsprechend wurden 7 Tage nach der Epilation auch pigmentierte Zellen in der Epidermis gefunden (Abb. 2E,F)., Darüber hinaus zeigte die quantitative RT-PCR 7 Tage nach der Epilation die Induktion vieler melanogenesebezogener Gene, einschließlich Tyr (2,84 ± 1,13-fache Kontrolle, n = 3), Tyrp1 (3,89 ± 0,72-fache, n = 3), Mitf (3,47 ± 0,38-fache, n = 3), Sox10 (2,13 ± 1,13-fache, n = 3), Pax3 (3,18 ± 0,43-fache, n = 3) und Ednrb (3,28 ± 0,62-fache, n = 3) (Abb. S6A). Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die Epilation die McSCs-Proliferation, die Migration in die Epidermis und die Stimulation des Melanogeneseprogramms induziert.,

Epilation induziert EDN3-Expression in Haarfollikeln und Epidermis

Unter den durch Epilation induzierten Genen war EDNRB aufgrund seiner bekannten Beteiligung an der Regulation der Melanozytenlinie von besonderem Interesse1, 12. Kürzlich wurde berichtet, dass die Expression seiner Liganden Edn1 und Edn2 während des physiologischen Haaranagens erhöht ist, aber seine Liganden-Edn3-Expression war nicht beeinflusst12. Daher fragten wir uns, ob die Epilation von Rückenhaaren diese Liganden induzieren würde., Zur Bestätigung der obigen Ergebnisse fanden wir heraus, dass während der physiologischen Regeneration die Expression von Edn1 und Edn2 in der Rückenhaut bei P26 erhöht war, die Edn3-Expression jedoch keine Veränderung zeigte (Abb. 3A und Abb. S11). Überraschenderweise induzierte die Epilation jedoch nicht nur die Expression von Edn1 und Edn2, sondern auch die von Edn3 (Abb. 3A), dessen kodiertes Produkt EDN3 zuvor nachweislich an der Melanozytenentwicklung beteiligt war1, 25, 26. Daher haben wir unsere Studie auf EDN3 und seinen Signalweg konzentriert. Wir fanden heraus, dass der EDN3-Proteinspiegel in epilierter Haut signifikant erhöht war (D0, 0.,94 ± 0,2-fach; D3, 1,81 ± 0,09-fach; D5, 4,57 ± 0,67-fach; n = 6) blieb aber niedrig in der Kontrollhaut (D0, 1,25 ± 0,47-fach; D3, 0,83 ± 0,14-Fach; D5, 1,21 ± 0,2-fach; n = 6) (Abb. 3B und Abb. S12). Die Immunhistochemie zeigte, dass am Epilationstag 1 das EDN3-Protein in der Hautpapille, der Epidermis und dem sekundären Haarkeim erhöht war. Am Tag 7 war es auch in den Öffnungen der Haarfollikel erhöht (Abb. 3C). Die Regionen mit hohen epilationsinduzierten EDN3-Spiegeln standen in engem Kontakt mit den MSCs im sekundären Haarkeim (sHG) oder mit Melanozyten der Haarzwiebel., Mit adulten heterozygoten Ednrb lacZ / + – Mäusen fanden wir dann heraus, dass EDNRB in pigmentierten Melanozyten von Haarzwiebeln und in sHG exprimiert wird, ähnlich der Expression von Dct-lacZ in Haarfollikeln (Abb. DREIDIMENSIONAL). Darüber hinaus zeigten Immunstainingsdaten, dass β-Gal-positive Zellen mit KIT-positiven Zellen in sHG und mit MITF-positiven Zellen in Haarzwiebeln co-markiert waren (Abb. 3E), was darauf hindeutet, dass EDNRB in MSCs und Melanozyten exprimiert wird., As expected, 7 days after epilation, western blot analysis and immunostaining data showed that Ednrb-lacZ expression is significantly increased in melanocytes (Figs S6B,C and S13). These results suggest that epilation induces EDN3, which then stimulates its receptor EDNRB to regulate McSCs and melanocytes.

EDN3 ist bekannt für seine Wirkungen auf die Stimulierung des Wachstums und der Differenzierung von Melanozytenvorläuferen1, 25, 26., Kürzlich wurde berichtet, dass eine transgene Überexpression von EDN3 das Ergrauen von Haaren verhindert, das durch wiederholte Epilation verursacht wird27, was darauf hindeutet, dass EDN3 auch McSCs beeinflusst. Um die Wirkung von EDN3 auf McSCs zu untersuchen, isolierten wir DCT + – Zellen aus der E16. 5 Wildtyp-Epidermis und stimulierten sie mit EDN3 oder BQ788 (einem EDNRB-Inhibitor). Wie in Abb. S7A, Stimulation mit EDN3 erhöht signifikant die Proliferationsrate der DCT+ – Zellen (von 43,7 ± 2% bis 61,4 ± 7,5%, n = 5), aber dieser Effekt von EDN3 wurde vollständig durch BQ788 blockiert (26,4 ± 1,56%, n = 5)., Basierend auf den Tatsachen, dass DCT für unpigmentierte Zellen ein spezifischer Marker für MSCs ist und dass es keine reifen Melanozyten in der E16.5-Epidermis4, 28 gibt, deutet das Ergebnis darauf hin, dass EDN3/EDNRB für die McSC-Proliferation erforderlich ist.

Ednrb wird für epilationsinduzierte Haar-und Hautpigmentierung benötigt

Um die Bedeutung der EDNRB-Signalisierung für epilationsinduzierte Hauthyperpigmentierung zu bewerten, verwendeten wir homozygote Ednrb lacZ/ lacZ (Ednrb−/−) – Mäuse. Solche Mäuse sind weitgehend frei von Pigmentzellen, behalten aber Pigmentflecken an der Basis des Kopfes und des Schwanzes., Vierzehn Tage nach der Epilation in der Kopfregion wurden regenerierende Haare bei Wildtyp-Mäusen (2,41 ± 0,55-fach, n = 5) hyperpigmentiert, jedoch nicht bei Ednrb – / – Mäusen (Abb. 4A,B). Bei nicht epilierten Ednrb – / – Mäusen waren die Melaninspiegel von Haarschäften niedriger (0,51 ± 0,06-fach, n = 5) als bei Kontrollwildtyp-Mäusen (1,02 ± 0,14-fach, n = 5) (Abb. 4B). Darüber hinaus war die Repigmentierung der Haut bei Wildtyp-Mäusen signifikant erhöht, bei Ednrb – / – Mäusen jedoch nur geringfügig (Abb. 4C). Die durch Epilation induzierten Hautmelaninspiegel waren bei Ednrb−/− Mäusen signifikant niedriger (1,85 ± 0.,79-fach, n = 9) verglichen mit denen bei Wildtyp-Mäusen (5,1 ± 0,62-fach, n = 9). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Deletion von Ednrb die epilationsinduzierte Haarhyperpigmentierung und Hautrepigmentierung stört. Darüber hinaus ist der Verlust von EDNRB mit dem Ergrauen der Haare verbunden. Die Melaninspiegel von pigmentierten Haarschäften von Ednrb – / – Mäusen waren zwischen einem Monat (0,96 ± 0,1-fach, n = 4) und bis zu 12 Monaten (0,37 ± 0,12-fach, n = 4) im Gegensatz zu ihren Spiegeln in Haarschäften von Wildtyp-Mäusen (1,96 ± 0,17-fach, n = 4 nach einem Monat; 2,15 ± 0,43-fach, n = 4 nach 12 Monaten) reduziert (Abb. S7B).,

Um zu untersuchen, ob EDNRB-Signalisierung für epilationsinduzierte Hyperpigmentierung in der hinteren Haut erforderlich ist, führten wir eine intradermale Injektion von BQ788 nach der Epilation von Wildtyp-Mäusen durch. Wie in Abb., Während die intradermale NaCl-Injektion nach der Epilation eine Hauthyperpigmentierung ermöglichte (von 0,23 ± 0,06-Fach bis 1,0 ± 0,15-fach, n = 3), verringerte die Injektion von BQ788 die epilationsinduzierte Hautpigmentierung signifikant (0,76 ± 0,1-fach, n = 3). Dieser Befund legt nahe, dass eine pharmakologische Störung der EDNRB die epilationsbedingte Hauthyperpigmentierung in der hinteren Haut blockieren kann. Zusammengenommen deuten diese Daten darauf hin, dass EDNRB-Signalisierung für epilationsinduzierte Hyperpigmentierung erforderlich ist.,

EDNRB beeinflusst die McSC-Proliferation in Haarfollikeln und reguliert die Melanogenese-bedingte Genexpression

Um zu untersuchen, wie der Mangel an Ednrb die Hautpigmentierung verringert, analysierten wir histologisch die Pigmentierung von Haarfollikeln auf der Kopfhaut (die, wie erwähnt, in Ednrb−/− Mäusen im Gegensatz zum Rücken pigmentiert bleibt). Wie in Abb., 5A, am Tag 5 nach der Epilation, Haarzwiebeln und Haarschäfte von Ednrb−/− Mäusen waren normalerweise in der Kopfhaut vorhanden, waren aber im Vergleich zu denen von Wildtyp-Mäusen hypopigmentiert, was darauf hindeutet, dass der Verlust von EDNRB den Haarzyklus nicht beeinflusst, aber die Melanozytenzahlen oder die Melaninsynthese in der Birne verringert. Tatsächlich war die Melanosomzahl von Ednrb−/− Mäusen 7 Tage nach der Epilation viel niedriger als die von Wildtyp-Mäusen (Abb. 5B)., Darüber hinaus konnten melanozytenspezifische Marker wie PMEL17 und TYR 5 Tage nach der Epilation nicht in der Dermis, in den Öffnungen der Haarfollikel oder in der interfollikulären Epidermis von Ednrb−/− Mäusen nachgewiesen werden, obwohl sie in Haarzwiebeln auf niedrigem Niveau vorhanden waren (Abb. S7C). Darüber hinaus blieben das McSC-Markerkit und pigmentierte Melanozyten auch 7 Tage nach der Epilation nicht nachweisbar (Abb. 5C und Fig. S7D). Diese Ergebnisse deuteten darauf hin, dass EDNRB für die epilationsinduzierte Regeneration epidermaler Melanozyten erforderlich ist.,

Um zu analysieren, wie der Verlust von EDNRB den Melaninspiegel von Haarzwiebeln senkt, quantifizierten wir dann Melanozytenzahlen in jeder Haarzwiebel von Wildtyp und Ednrb−/− Mäusen 7 Tage nach der Epilation., Die Anzahl der MITF-positiven Zellen bei der Epilation war in jedem Haarfollikel von Ednrb−/− Mäusen (11,7 ± 2,2) im Vergleich zu Haarfollikeln bei Wildtyp-Mäusen (15,7 ± 1,43) niedriger (Abb. S7D). Dieses Ergebnis deutete darauf hin, dass der Verlust von EDNRB die epilationsinduzierte Proliferation von Melanozyten-Stammzellen blockieren könnte. Vor kurzem, Takeo et al. fand heraus, dass während der physiologischen Haarregeneration EDNRB-Signalisierung auch für die McSCs-Proliferation und-wartung erforderlich ist29. Ob EDNRB die epilationsinduzierte McSC-Proliferation beeinflusst, war jedoch noch unbekannt., Da EDN3 in der Hautpapille in unmittelbarer Nähe zu reifen Melanozyten in der Haarzwiebel exprimiert wird, haben wir getestet, ob die EDN3 / EDN3-Signalgebung die McSC-Proliferation in der Ausbuchtung beeinflusst oder die Melaninsynthese in follikulären Melanozyten stimuliert. In der Kopfhaut zeigten Anti-KIT-und Ki67-Immunfärbungsdaten, dass 3 Tage nach der Epilation die McSC-Proliferation in jeder Haarwölbung von Ednrb – / – Mäusen (52 ± 5,2%) niedriger war als in entsprechenden Ausbuchtungen von Wildtyp-Mäusen (86,2 ± 3,5%) (Abb. 5D). Dies deutet darauf hin, dass EDNRB auch für Epilation-induzierte McSC-Proliferation in der Haarwölbung erforderlich ist.,

Um weitere Einblicke in die zugrunde liegenden Mechanismen zu erhalten, isolierten wir Melanozyten für die In vitro-Kultivierung. Wie in Abb. 5E, die Pigmentierung von Ednrb – / – primären Melanozyten aus pigmentierten Kopfhaarfollikeln von P6 Ednrb – / – Mäusen war niedriger (0,47 ± 0,1-fach, n = 5) als die von primären Melanozyten vom Wildtyp (1,0 ± 0,1-fach, n = 5). Ähnliche Ergebnisse wurden in Zellpellets oder bei direkter Messung des Melaningehalts erhalten (Abb. 5F). Wir analysierten dann, ob EDNRB-Signalisierung die Expression von Melanogenese-verwandten Genen beeinflussen würde. Wie in Abb., 5G, am Tag 7 nach der Epilation war die Expression von Melanogenese-verwandten Genen in Ednrb−/− scalp verringert, einschließlich Expression von Pax3 (0,47 ± 0,07-fach, n = 3), Tyr (0,55 ± 0,05-Fach, n = 3) und Tyrp1 (0,5 ± 0,02-fach, n = 3). Dies legt nahe, dass die EDN3 / EDN2-Signalgebung sowohl an der Melanozytenproliferation als auch an der Melanogenese während epilationsinduzierter regenerativer Reaktionen von MSCs beteiligt ist. Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die Epilation eine Melanogenese-bedingte Genexpression durch EDN3/EDN2-Signalgebung induziert und wiederum zu einer Hyperpigmentierung von Haut und Haar führt.