Grenzen in der Mikrobiologie

Einführung

Bacillus thuringiensis und die anderen 7 Arten von sporenbildenden grampositiven Bakterien, einschließlich B. cereus, B. cytotoxicus, B. anthracis, B. pseudomycoides, B. weihenstephanensis, B. toyonensis und B. mycoidesare, werden hauptsächlich im Boden nachgewiesen.. Da diese Bakterien im Genotyp und Phänotyp sehr ähnlich sind, werden die Bakterien in der Taxonomie als B. cereus-Gruppe klassifiziert (Park et al., 2007). B., cereus und B. thuringiensis sind in Lebensmitteln hoch nachweisbar, da sie in Rohstoffen aus landwirtschaftlichen Böden während des Anbaus und der Verteilung beobachtet werden. Darüber hinaus werden diese beiden Bakterien in der klinischen Diagnostik normalerweise nicht diskriminiert. B. cereus ist eine zweite Risikoprioritätsgruppe lebensmittelbedingter Krankheiten in frischen landwirtschaftlichen Erzeugnissen, und seine Kontamination ist eines der Hauptprobleme bei Gemüse (Felício et al., 2015). Insbesondere, B., thuringiensis wurde als Pestizid beim Anbau bestimmter Kulturen verwendet und ist bekannt als mikrobielle Insektizide, die verwendet wurden, um die Menge an chemischen Pestiziden zu reduzieren (Azmi et al., 2015).

B. thuringiensis produziert insektizide Proteine, die die Hauptart kristalliner (kristalliner) Proteine sind (Kutasi et al., 2016). Umgekehrt führen aktiv wachsende vegetative Zellen, denen die Kristallproduktion fehlt, zu ungiftigen Wirkungen. Die δ-Endotoxine enthalten hauptsächlich Zytolytika (Cyt) und Enzyme (Elleuch et al., 2015; Rao et al., 2015)., Cyt und Cry besitzen jedoch unterschiedliche Sequenzhomologien, obwohl sie aus ähnlichen Wirkungsweisen gegenüber der Zelllyse bestehen, die zu einer dauerhaften Schädigung des Insekts Midgut führen (Adang et al., 2014).

Die strukturelle Variation von vier δ-Endotoxinen (Cry1, Cry2, Cry3 und Cyt2Ah) wurde durch Röntgenkristallographie beobachtet (Dehury et al., 2013). Diese Gene werden in transgener Baumwolle und anderem Gemüse identifiziert, die bei der Bekämpfung von Schädlingen erheblich wirksam sind., Die Entwicklung eines Biomarkers für das übersetzte Produkt variiert je nach den verschiedenen Kategorien des Proteins; Daher wird der Nachweis komplex sein. Die 16S rRNA – Gensequenzen basierend auf Universalprimern zeigten einen hohen Ähnlichkeitsindex (>99%) zwischen B. cereus und B. thuringiensis (Böhm et al., 2015), die nicht mit genetischen und phänotypischen Assays klassifiziert werden können (Peng et al., 2015). Darüber hinaus wird seit 2000 diskutiert, ob die gesamte B. cereus-Gruppe als komplexe Spezies verschiedener Bakterien behandelt werden sollte (Helgason et al.,, 2000; Bartoszewicz und Marjańska, 2017). Es gibt auch Vorschläge, dass die Phylogenie dieser Bakterien besser zu ihren ökologischen Eigenschaften (Psychrotoleranz, Virulenz) passt als zur taxonomischen Zugehörigkeit (Drewnowska und Swiecicka, 2013; Bartoszewicz und Marjańska, 2017). Um dieses Problem zu lösen, haben wir XRE zum Nachweis von B. thuringiensis ins Visier genommen, das die Hauptart der Kristallproteinproduktion steuert.

Diese beiden Bakterien sind in biochemischen Ergebnissen sehr ähnlich (Böhm et al., 2015) und genetische Eigenschaften (Osman et al., 2015). Cho et al., (2015) berichtete auch, dass die genetischen und phänotypischen Eigenschaften zwischen diesen Bakterien kaum unterscheidbar sind. Darüber hinaus Pfrunder et al. es wurde berichtet, dass Arten der B. cereus-Gruppe mit klassischer Biotypisierung nicht zuverlässig identifiziert werden können (Pfrunder et al., 2016). Basierend auf diesen könnten die biochemischen Experimente nicht für die Differenzierung ausreichen. Stattdessen wurde das Vorhandensein eines insektiziden Kristallproteins als Unterscheidungsmerkmal zur Differenzierung dieser Bakterien verwendet (Ekino et al., 2014; Wei et al., 2018).,

Einige der Faktoren, die diese beiden Bakterien unterscheiden, basieren auf ihrer Pathogenität in Proben. B. cereus verursacht gastrointestinale Störungen, während B. thuringiensis auch an Durchfallepidemien beteiligt war. Wie berichtet, ist das Unterscheidungsmerkmal von B. thuringiensis das Vorhandensein von insektiziden Kristallproteinen (δ-Endotoxin), die durch Cry-Gene verschlüsselt sind (Osman et al., 2015; Albright et al., 2016). Da die Identifikationsmethode mit dem Biomarker zur Differenzierung B., cereus group ist komplex und zeitaufwendig, ein hocheffizienter Biomarker ist dringend erforderlich, um die vorherigen zu ersetzen, die eine geringere Effizienz zeigten und manchmal sogar falsche Ergebnisse zeigten. Basierend auf den beiden spezifischen Genen, dem Transkriptionsregulator und den Kristallproteingenen für B. thuringiensis (Porcar und Juárez-Pérez, 2003; Han et al., 2006) wurde die aktuelle Studie durchgeführt, um die Effizienz des entworfenen Biomarkers (XRE) mit der des vorhandenen Kristallproteinmarkers (cry2) bei der Identifizierung von B. thuringiensis aus B. cereus-Gruppenstämmen (Bcg) und Nicht-B zu untersuchen und zu vergleichen., cereus-Gruppenstämme (Nicht-B) in Lebensmitteln. cry2ist das häufigste Kristallprotein in B. thuringiensis (Liang et al., 2011; Palma et al., 2014).

Materialien und Methoden

Bakterienkulturen Vorbereitung

Alle 120 Stämme, einschließlich 111 von Bcg und 9 Nicht-B, wurden aus Bakteriensammlungen in den Vereinigten Staaten und Südkorea erhalten (ergänzende Tabelle 1). Unter den Sammlungen wurde B. thuringiensis ATCC 10792 (Typstamm) zur Optimierung der experimentellen Bedingungen herkömmlicher PCR und Echtzeit-PCR verwendet., Alle Stämme wurden bei Raumtemperatur (25°C) aufgetaut und auf den Nährstoff-Agar gestreift (Difco, MI, USA). Nach 24 h Kultivierung bei 35°C im Inkubator wurde eine reine Kolonie gepflückt und in tryptische Sojabrühe (Difco, MI, USA) geimpft und Nachtkulturen für nachfolgende Experimente verwendet.

Primerdesign und DNA-Isolierung

Die jeweiligen Primer zielen auf XRE zur Differenzierung von B., thuringiensis (Tabelle 1) wurden gemäß der folgenden Sequenz in Bacillus thuringiensis ATCC 10792 (Gene – 3664610-3665047) unter Verwendung der Primer Express® – Software (Version 3.0.1) von Applied Biosystems in CA, USA, entwickelt und von der Bioneer Corporation aus Daejeon, Korea, synthetisiert. Die Leistung von designed XRE wurde mit cry2 verglichen (Ben-Dov et al., 1997). Nach 24 h Anreicherung in TSB wurde ein Aliquot von 1 ml Bakterien der genomischen DNA-Extraktion unter Verwendung des PrepMan® Ultra Sample Preparation Reagens (Applied Biosystems, CA, USA) unterzogen., Die DNA-Konzentrationen wurden mittels Eppendorf BioSpectrometer® fluorescence (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) gemessen und auf 10 ng/µL eingestellt. DNA-Proben wurden vor Gebrauch bei -20°C gelagert.

Konventioneller PCR-und Echtzeit-PCR-Assay

Die konventionelle PCR wurde mit einem C1000 TouchTM Thermal Cycler von Bio-Rad in Hemel Hempstead, Großbritannien, hergestellt., Die Reaktionsröhre für die PCR verwendet Accu-Power® Pyro Hot Start Taq PCR Pre-Mix von Bioneer Corporation in Daejeon, Korea und ein Volumen von 20 µL, einschließlich 1 µL von jedem Primer (10 pmoL/µL) und 2 µL DNA. Verstärkungsbedingungen der herkömmlichen PCR für Transkriptionsregler (XRE) waren: anfängliche Denaturierung bei 95°C für 5 min, gefolgt von 35 Zyklen der Denaturierung bei 95°C für 30 s, Glühen bei 49°C für 30 s und Dehnung bei 72°C für 30 s und eine endgültige Dehnung bei 72°C für 5 min., Amplifikationen Bedingungen für Kristallprotein (Cry2) waren: anfängliche Denaturierung bei 95°C für 5 min, gefolgt von 35 Zyklen der Denaturierung bei 95°C für 30 s, Glühen bei 55°C für 30 s und Dehnung bei 72°C für 1 min und eine endgültige Dehnung bei 72°C für 5 min. Nach DNA-Amplifikationen 1,5% (W/V) Agarose-Gellösung mit RedsafeTM Nucleinsäurelösung 20.000 × (Intron Biotechnology, Inc.) wurde hergestellt und die Gelelektrophorese wurde unter Verwendung des Subzellenmodells 192 von Bio-Rad in Hemel Hempstead, Vereinigtes Königreich, durchgeführt., Die Bänder wurden mit dem Smart View Pro UVCI-1100 Imager-System von Major Science in CA, USA, visualisiert. Die Genauigkeit (AC) wurde verwendet, um die PCR-Methode unter Verwendung der Primer XRE und cry2 beim Nachweis von B. thuringiensis aus Bcg und Nicht-B. Negative Übereinstimmung (NA) bedeutet das gleiche negative Ergebnis für Nicht-B. thuringiensis unter Verwendung von PCR mit XRE und cry2. Positive Übereinstimmung (PA) bedeutet das gleiche positive Ergebnis für B. thuringiensis mit PCR mit XRE und cry2. Die Genauigkeit (AC) wird unter Verwendung der folgenden Gleichung gemessen, AC = ×100% (Ma et al., 2014).,

Real-time PCR-Experimente wurden durchgeführt, indem die StepOneTM real-time-PCR-System von Applied Biosystems befindet sich in Kalifornien, Vereinigte Staaten. Ein Reaktionsvolumen von 20 µL bestehend aus 10 µL Schmelze DoctorTM High Resolution Melting (HRM) Master Mix, 2 µL DNA, 0,5 µL F/R Primer (10 pmoL/µL) (Tabelle 2). Verstärkungsbedingungen der qPCR waren: anfängliche Denaturierung bei 95°C für 10 min und 40 Zyklen bei 95°C für 15 s und 60°C für 1 min. Bei der anschließenden Schmelzkurvenanalyse wurde dann die Temperatur auf einen Anstieg von 60 auf 95°C bei 0,3°C/Zyklus eingestellt, um die Spezifität des Primers zu testen.,

Auswertung des Echtzeit-PCR-Assays

Die Leistung von XRE und cry2 wurde unter Verwendung von 50 B. thuringiensis-Stämmen bewertet, während die Exklusivität unter Verwendung von 70 Nichtzielbakterien getestet wurde, darunter 58 B. cereus (Bc), 3 Bcg und 9 non-B (Chelliah et al., 2017). Eine Standardkurve wurde unter Verwendung von 10-fachen Verdünnungen der aus B. thuringiensis ATCC 10792 extrahierten DNA erstellt., Die DNA-Konzentrationen wurden von 10 ng/µL auf 100 fg/µL eingestellt, entsprechend 2,6 × 106 bis 2,6 × 10 KBE, und die Amplifikationen wurden durch Echtzeit-PCR mit Triplikaten durchgeführt. Für Negativkontrollen wurde destilliertes Wasser verwendet. Negative Ergebnisse oder keine Verstärkungskurven wurden berücksichtigt, wenn die Zyklusschwellenwerte (Ct) mehr als 40 betrugen.

Nachweis von B. thuringiensis in Stachelproben

Salat (Lactucasativa), Kimbab und Spinat (Spinaciaoleracea) wurden von einem lokalen Markt in Chuncheon, Korea, gekauft., Die Proben wurden auf das Fehlen von Zielbakterien gemäß ISO 7932 (2004) getestet. Ein Aliquot von 50 g jeder Art von Lebensmitteln wurde in einem sterilen Magenbeutel von Nasco Whirl-Pak in WI, USA, zubereitet. Über Nacht wurden B. thuringiensis-Kulturen in 0,5% Peptonwasser verdünnt und zur Herstellung der künstlich kontaminierten Proben mit Inokulationswerten von 103 bis 105 KBE/g verwendet (Chon et al., 2012; Kim et al., 2013). Ein Aliquot von 1 ml der Suspension von Lebensmittelproben wurde in ein neues sterilisiertes Röhrchen überführt und zur DNA-Extraktion verwendet.,

Ergebnisse und Diskussion

Nachweis von B. thuringiensis unter Verwendung des cry2-Gens

Für die 120 Stämme wurden Amplifikationsprodukte von ungefähr 700 bp unter Verwendung der Primer cry2 erhalten (Tabelle 1). Wie in Tabelle 2 und Abbildung 1 gezeigt, wurden bei Verwendung von PCR-Targeting-cry2 6 B. cereus-Stämme und 36 B. thuringiensis-Stämme (72%) amplifiziert. Keine andere B. cereus-Gruppe oder Nicht-B-Gruppe wurde verstärkt. Dies zeigte eine Genauigkeit von 82% von cry2 zum Nachweis von B. cereus-Gruppen. Für die 120 getesteten Stämme gaben 100 Stämme NAs oder PAs an, was einen Gesamtgenauigkeitsprozentsatz von 83 anzeigt.,3% (Ergänzende Tabelle 1). Während Rioja et al. (2015) berichtete über eine Multiplex-PCR von nicht-ribosomalen Peptidsynthase (NRPS) – Genen und cry1 zur Identifizierung von B. cereus und B. thuringiensis mit einer Spezifität von 24,5% in B. cereus und 15% in B. thuringiensis.

Es wurde berichtet, dass der B. thuringiensis-Stamm ein oder mehrere Kristallproteine synthetisieren kann, da ein oder mehrere Kristalltoxin-Gene für B. thuringiensis gefunden wurden. Der Hauptgrund für die Vielfalt der Toxingene ist der Transfer von Plasmiden in B. thuringiensis (Adang et al., 2014). Es ist ein häufiger Prozess für den Plasmidtransfer entweder durch Konjugation oder Mobilisierung (Makart et al., 2017)., Ferner erzeugt der Austausch von Cry-Genen B. cereus mit einer neuen Bindung von cry, die zur Ähnlichkeit von B. cereus und B. thuringiensis führt (Fiuza, 2015). Darüber hinaus zeigten die Cry-Gene bei einer anderen Isolationsquelle einen Unterschied in Vielfalt und Verteilung. Zum Beispiel kann in jedem Lebensraum ein neuartiges Cry-Gen gefunden werden, das unterschiedliche insektizide Aktivität zeigt.

Nachweis von B. thuringiensis Mittels XRE-Gen

Potentialcodierungssequenzen (CDS) wurden als Transkriptionsregulatoren vorausgesagt., CDS enthält ein Helix-Turn-Helix (HTH)-Motiv in der XRE-ähnlichen Proteinfamilie und der MerR-Familie Transkriptionsregulatoren, zuvor die entsprechenden XRE-Gensequenzen in pBMB28 von B. thuringiensis YBT-020 und pCT281 von B. thuringiensis (GenBank: CP001910). CDS50, das mit dem Transkriptionsregler vom HTH-Typ, SinR, verwandt ist, war identisch mit dem entsprechenden Element pG9842 von B. cereus G9842 (GenBank: CP001187). Die HTH-Proteine nehmen zusammen mit Sigma-Faktoren an einer Vielzahl von Signalwegen teil, beispielsweise als Repressoren, die die Sporulation hemmen (Murawska et al.,, 2014), biofilm-Bildung (Colledge et al., 2011) und protease-Sekretion (Pflughoeft et al., 2011). Abgesehen von Cry1Ab21 und δ-Endotoxin, die im toxigenen Plasmid pIS56-63 kodiert sind und für Konjugation und Sporulation verantwortlich sind (Martínez-Núñez et al., 2010; Deng et al., 2014) zusätzlich mit 53 verschiedenen kodierten mutmaßlichen Proteinen.

Die PCR-Ergebnisse mit XRE zeigten, dass keiner der 58 B. cereus oder Non-B eine Verstärkung ergab (Tabelle 2 und Abbildung 1). Insgesamt zeigten von 50 Stämmen von B. thuringiensis 47 positive Ergebnisse (94%). Dies zeigte eine Genauigkeit von 97.,3% XRE zum Nachweis von B. thuringiensis unter den getesteten B. cereus-Gruppen. Für die 120 getesteten Stämme gaben 117 Stämme NAs oder PAs an, was einen Gesamtgenauigkeitsprozentsatz von 97,5% anzeigt (ergänzende Tabelle 1).

Standardkurve und Amplifikationseffizienz

Der Echtzeit-PCR-Assay wurde unter Verwendung der DNA-Extrakte aus den Reinkulturen des B. thuringiensis-Stammes ATCC 10792 durchgeführt, die auf das XRE-Gen abzielen. Der entwickelte Echtzeit-PCR-Assay war effizient zum Nachweis von Konzentrationen von 2,6 × 10 bis 2,6 × 106 KBE / Reaktion, die 6 Größenordnungen umfassten., Die Gleichung log Kopienzahl gegenüber dem Ct-Wert für B. thuringiensis war y = -3.853 x+21.244 mit einem R-Quadrat-Wert von 0.993, der angibt, die hohe Linearität (Abbildung 2).

Nachweis von stacheligen Lebensmittelproben

Kürzlich wurde berichtet, dass B. thuringiensis in Lebensmitteln wie Milch, frischem Obst und Getreide nachgewiesen wurde, die aus Böden außerhalb des Landes angebaut und geerntet wurden., Der Verzehr von rohem und minimal verarbeitetem Gemüse gilt als natürlich und gesund, es wurden jedoch Bedenken hinsichtlich chemischer Pestizide in frischem Gemüse geäußert (Chiu et al., 2016). So haben die Verbraucher ihr Interesse an Bio-Gemüse (chemiefreies Gemüse) gewandt, und es wird prognostiziert, dass Bio-Pestizide, einschließlich B. thuringiensis, bis 2020 20% des weltweiten Pestizidmarktes als Ersatz für chemische Pestizide ausmachen können (Watts und Williamson, 2015)., In dieser Studie, die performance der real-time PCR targeting-XRE wurde bewertet mit 3 Arten von künstlich kontaminierten Lebensmittelproben (Salat, kimbap und Spinat). In jede Lebensmittelprobe wurden frische Nachtkulturen von B. thuringiensis geimpft. Die Echtzeit-PCR konnte B. thuringiensis in einer Konzentration von 4,8 × 103, 3,4 × 103 und 1,5 × 103 KBE/g in Salat, Kimbap und Spinat erfolgreich nachweisen (Abbildung 3). Bei Kimbap-Proben waren die Ct-Werte jedoch höher, da sie im Vergleich zum Gemüse in der Regel komplexere Materialien wie Wurst, Ei oder Karotte enthalten.,

Schlussfolgerung

Da die B. cereus-Gruppe sowohl in biochemischen als auch in genetischen Profilen sehr ähnlich ist, wurde ein neuer Biomarker zur Identifizierung und Unterscheidung von B. thuringiensis von der eng verwandten Gruppe entwickelt. Die Leistung von XRE wurde mit cry2-Gen verglichen und künstlich kontaminierte Proben wurden ebenfalls getestet. Im Vergleich zu cry2 wurde beobachtet, dass das XRE-Gen bei der Identifizierung von B. thuringiensis effizient genau ist. Ferner identifizierte die entwickelte Echtzeit-PCR unter Verwendung von XRE erfolgreich B., thuringiensis und es könnte verwendet werden, um Zellzahlen mit der erzeugten Standardkurve zu quantifizieren.

Autorenbeiträge

Finanzierung

Diese Forschungsarbeit wurde 2015 vom Ministerium für Landwirtschaft, Lebensmittel-und Arzneimittelsicherheit (Grant No. 14162MFDS085) der Republik Korea und der Kangwon National University unterstützt. SW war dankbar für die finanzielle Unterstützung durch den China Scholarship Council (CSC No: 201408260054). Die Autoren danken Hyun-Ah Lee am Zentrallabor der Kangwon National University für die technische Unterstützung., RC ist dankbar für die finanzielle Unterstützung aus dem National Research Foundation of Korea (NRF) 2018007551.

Interessenkonflikterklärung

Die Autoren erklären, dass die Untersuchung ohne kommerzielle oder finanzielle Beziehungen durchgeführt wurde, die als potenzieller Interessenkonflikt ausgelegt werden könnten.

Ergänzendes Material