Integralmembranproteine
Integralmembranproteine (IMPs) fungieren als Gateways zu Zellen. Alle Zellen und Organellen sind in einer undurchlässigen Lipiddoppelschicht eingeschlossen und die von uns untersuchten IMPs sind in diese Membranen eingebettet. Sie sind die Ein-und Ausstiegswege für viele Ionen, Nährstoffe, Abfallprodukte, Hormone, Medikamente und große Moleküle wie Proteine und DNA. Sie sind auch für einen Großteil der Kommunikation zwischen Zellen und ihrer Umgebung verantwortlich., Zellen können eine große Vielfalt dieser Proteine herstellen, ungefähr 30% der Gene im menschlichen Genomcode für Membranproteine, und dennoch wissen wir relativ wenig über diese Moleküle.
Membranproteine sind leider notorisch schwer zu handhaben und zu untersuchen, da sie in der hydrophoben Umgebung der Lipiddoppelschicht sitzen. Sie neigen dazu, instabil zu sein, wenn sie aus ihrer natürlichen Umgebung extrahiert werden, und wir müssen Reinigungsmittel hinzufügen, um die hydrophobe Oberfläche abzudecken., Um die Funktion dieser Proteine zu verstehen und zu kontrollieren, ist es wichtig, Informationen über ihre dreidimensionale Struktur zu haben, die normalerweise durch Röntgenkristallographie erhalten wird. Die Schwierigkeit beim Umgang mit diesen Proteinen hat es jedoch schwierig gemacht, die Strukturen zu lösen, und bis heute sind weniger als 300 Strukturen von Membranproteinen bekannt, weniger als 0,5% aller bekannten Strukturen. Für höhere Eukaryoten ist die Geschichte noch krasser, mit nur 20 Strukturen von menschlichen IMPs und weniger als 50 Säugetier IMPs gelöst., Membranproteine sind daher eine der wichtigsten verbliebenen Grenzen der strukturbiologischen Forschung. Bei der SGC wenden wir jetzt unsere hochmodernen Hochdurchsatzmethoden an, um die Engpässe in der Membranproteinforschung zu überwinden, so dass wir zuverlässig reine Membranproteinproben und Strukturen dieser faszinierenden und medizinisch kritischen Moleküle liefern können.
Medizinische Bedeutung
Die medizinische Bedeutung dieser riesigen Proteinfamilie kann nicht überschätzt werden., Mutationen in Membranproteinen sind an vielen häufigen Krankheiten beteiligt, einschließlich Herzerkrankungen, bei denen häufig fehlerhafte Ionenkanäle beteiligt sind. Medikamente, die auf Kalziumkanäle abzielen, können Probleme wie Bluthochdruck und Angina kontrollieren. Membranproteine sind an Krebs beteiligt, bei dem Fehler in Signalwegen dazu führen können, dass sich Zellen außer Kontrolle teilen. Oft werden spezifische Membranproteine in Krebszellen überproduziert und sind daher Ziele für die medikamentöse Therapie. Erkrankungen des Gehirns wie Migräne, Depressionen und Alzheimer sind alle mit Problemen mit Transportern und Kanälen verbunden., Mukoviszidose wird durch Mutationen im Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) – Gen verursacht, das für einen Chloridionenkanal kodiert.
Da viele Membranproteine an der Oberfläche von Zellen sitzen, sind sie für im Blut zirkulierende niedermolekulare Arzneimittel leicht verfügbar. Es ist daher nicht verwunderlich, dass über 50% der niedermolekularen Arzneimittel an Membranproteine binden. G-Protein gekoppelte Rezeptoren und Kanäle sind in dieser Hinsicht besonders wichtig, aber ABC-Transporter und gelöste Träger sind auch Ziele für die medikamentöse Therapie., Unser Verständnis vieler anderer Krankheiten und unsere Fähigkeit, diese Krankheiten zu behandeln, würden stark von mehr strukturellen und funktionellen Informationen über die beteiligten Proteine profitieren. Wir hoffen, dass wir durch die Lösung der Strukturen dieser Proteine, das Verständnis der zugrunde liegenden Biochemie und Wechselwirkungen mit Substraten und Inhibitoren wirksamere Behandlungen für viele Krankheiten anbieten können.
SGC und integrale Membranproteine
SGC verfügt über umfangreiche Erfahrung in der Lösung von Strukturen löslicher menschlicher Proteine unter Verwendung hocheffizienter Hochdurchsatzsysteme., In den letzten zwei Jahren haben wir diese Methoden an die Lösung von Strukturen für menschliche Membranproteine angepasst. Wir haben 186 menschliche Membranproteine aus verschiedenen Familien gescreent, eine Reihe von Konstrukten für jedes Protein ausgewählt, geeignete Reinigungsmittel für die Reinigung identifiziert und dann das Purificaiton skaliert und diese Proteine kristallisiert. Wir haben 3 Membranproteine kristallisiert und unsere erste Struktur gelöst, ein Prozess, der vom ersten Klon bis zur Struktur weniger als zwei Jahre dauerte.,
Wir haben die erste Struktur eines menschlichen ABC-Transporters gelöst, eine Klasse von Proteinen, die am Transport kleiner Moleküle, an Multiresistenzen und Krankheiten wie Mukoviszidose und Diabetes beteiligt sind. Unser erstes erfolgreiches Ziel ist der menschliche mitochondriale ABC-Transporter ABCB10, der in die innere Membran der Mitochondrien eingebettet ist. ABCB10 wird während der Erythroiddifferenzierung, dem Prozess, der rote Blutkörperchen bildet, überexprimiert. es ist in Knochenmark, Herz und Leber überexprimiert., Es gibt nun Hinweise darauf, dass ABCB10, wenn die Expression in Zellen reduziert wird, anfälliger für oxidativen Stress ist und dass ABCB10 möglicherweise am Schutz des Herzens während eines Herzinfarkts beteiligt ist.
Technologien zur Untersuchung von IMPs
Wir entwickeln generische Methoden, die die Hochdurchsatzbestimmung von Strukturen menschlicher Membranproteine ermöglichen. Wir haben das Baculovirus/Insektenzell-Expressionssystem ausgewählt, das eine Lipidzusammensetzung nahe der menschlichen Zellen liefert und eine bewährte Plattform mit hohem Durchsatz ist., Für jedes Zielprotein generieren wir eine Reihe von Konstrukten unterschiedlicher Länge und unterschiedlicher Affinitätsmarken, einschließlich des Gens in voller Länge und einer Reihe von Schnitten, um potenziell ungeordnete Regionen zu entfernen. Ein Expressionsschirm mit hohem Durchsatz wird verwendet, um Proteine zu identifizieren, die zur Reinigung von Milligrammmengen von IMPS zur Kristallisation verwendet werden können. Jedes Protein wird zunächst in Dodecylmaltosid (DDM) – Detergenzien gereinigt und anschließend in einer Reihe verschiedener Detergenzien auf Stabilität geprüft, um die optimalen Bedingungen für Stabilität und Kristallisation zu ermitteln.,
Wir haben Methoden zur Nanodrop-Kristallisation mit hohem Durchsatz und zur Manipulation fragiler Membranproteinkristalle etabliert. Wir haben effiziente Systeme zur Abschirmung von Membranproteinkristallen auf Beugungsqualität als Methode zur kristallisationsbedingten Optimierung entwickelt. Wir haben auch unsere Datenerfassung und-analyse von Beugungsdaten mit intensiven Synchrotron-Mikrofokus-Beamlines optimiert, die bei Ressourcen wie Diamond Light Source Ltd in Oxfordshire erhältlich sind., Wo immer möglich, wird die Kristallisation mit gebundenen Liganden und Inhibitoren durchgeführt, um eine einzige native Konformation zu erfassen und wichtige Einblicke in Funktion und Wirkstoffdesign zu geben. Wir planen auch, Antikörperfragmente gegen unsere gereinigten Proteine zur Verwendung als Affinitätsreagenzien und Kristallisationshilfen zu erzeugen.
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