Mittelkettige Fettsäuren senken Serumcholesterin über Reduktion der Darmgallensäure-Reabsorption in C57BL / 6J-Mäusen

Tiere und Diäten

Männliche C57BL / 6 J-Mäuse (4 Wochen alt, n = 80) wurden vom Institut für Labortierwissenschaften der Chinesischen Akademie der medizinischen Wissenschaften (Lizenz Nr. SCXK: JING2009-0007) und in einem temperaturgesteuerten Raum (22 ± 2 °C, 40% bis 60% Luftfeuchtigkeit) mit einem 12-h-Hell/Dunkel-Zyklus untergebracht., Das Animal Care and Use Committee des chinesischen PLA General Hospital genehmigte alle experimentellen Verfahren.

Mäuse wurden in der ersten Woche zur Anpassung mit einer Basaldiät (AIN-93G-Diät, gekauft von der Akademie der Militärmedizin) gefüttert. Zehn Mäuse wurden zufällig ausgewählt und erhielten eine Basaldiät als normale Kontrolle, und die restlichen Mäuse erhielten eine cholesterinreiche (CR) Diät, die von der AIN-96G-Diät modifiziert wurde. Zwei Wochen später wurden Blutproben aus dem Plexus mandibularis venosa entnommen., Mäuse mit Serum-TC-Spiegeln, deren Standardabweichungen 2 größer waren als die normale Kontrolle (67% der Mäuse, die mit der CR-Diät gefüttert wurden), wurden zufällig drei Gruppen zugewiesen (n = 12 in jeder Gruppe). Jede Gruppe erhielt 16 Wochen lang eine andere Diät (Tabelle 1): cholesterinreiches und mittelkettiges Triglycerid (CR-MCT), cholesterinreiches und langkettiges Triglycerid (CR-LCT) oder CR. Nisshin Oillio (Tokio, Japan) spendete die MCTs (C8:0 und C10:0) und LCTs (langkettige Triglyceride, Sojabohnenöl). Cholesterin wurde gekauft von Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)., Das Beijing Institute of Nutrition Resources (Peking, China) hat die Fettsäurezusammensetzungen der CR-MCT-und CR-LCT-Diäten gemessen (Tabelle 2). Körpergewicht und Nahrungsaufnahme wurden wöchentlich überwacht.,

Blut -, Ileum -, Galle-und Kotproben

Fünf Mäuse wurden nach 16 Wochen Fütterung zufällig ausgewählt, um die Nahrungsaufnahme und die Kotausscheidung mit separaten Stoffwechselkäfigen für 3 Tage aufzuzeichnen., Fäkalien wurden lyophilisiert, gewogen, pulverisiert und bei − 80 °C zur weiteren Analyse gelagert. Alle Mäuse wurden über Nacht (ungefähr 12 h) vor der Blutentnahme aus der Aorta ventralis unter Narkose (Xylazinhydrochlorid) gefastet. Das Serum wurde nach Zentrifugation der Blutproben entnommen. Eine Mikrokapsel wurde verwendet, um die Gallenblasenwand zu punktieren und die Galle zu extrahieren, und jede Gallenprobe wurde bei 16.000 g für 30 min zentrifugiert. Der überstand wurde gesammelt und bei − 80 °C., Ileumgewebe wurden ausgeschnitten und mit eiskalter Kochsalzlösung gespült, und Teile wurden sofort bei-80 °C zur weiteren Analyse gelagert.

Messung der Serumlipidprofile

Serum-TC und Triglycerid (TG) wurden am Ende des Experiments mit kommerziellen Kits von Wako (Osaka, Japan) bestimmt. High-Density-Lipoprotein-Cholesterin (HDL-C) und Low-Density-Lipoprotein-Cholesterin (LDL-C) wurden mit Sedimentmethoden und einem kommerziellen Kit von Abcam (Cambridge, UK) gemessen. Serum insgesamt Gallensäure (TBA) wurde mit einem kommerziellen Kit von Blue Gene (Shanghai, China) gemessen., Alle Anweisungen des Herstellers wurden strikt befolgt.

Analyse von Gallensäuren in Fäkalien und Galle mit HPLC-MS

Die Methoden zur Herstellung und Bestimmung von Gallensäuren in Fäkalien und Galle wurden nach unserer vorherigen Studie und Berichten von Steiner et al. . Es wurde ein Shimadzu LC-20 AD Hochleistungsflüssigchromatographiesystem (Shimadzu, Kyoto, Japan) verwendet, das mit einem angewandten Biosystecm 3200 Q-Massenspektrometer mit einer Elektrospray-Ionisationsquelle (Applied Biosystems, Carlsbad, USA) gekoppelt ist. Die HPLC-und MS-Systeme wurden mit Analyst 1.4 gesteuert.,2 software. All chromatographic separations were performed using a Venusil AQ C18 column (2.5 μm, 50 mm × 2.1 mm) (Agela Techonologies, Delaware, USA). Cholic acid (CA), deoxycholic acid (DCA), chenodeoxycholic acid (CDCA), ursodeoxycholic acid (UDCA), lithocholic acid (LCA), taurocholic acid (TCA), taurodeoxycholic acid (TDCA), taurochenodeoxycholic acid (TCDCA), taurolithocholic acid (TLCA), glycocholic acid (GCA), glycodeoxycholic acid (GDCA) and glycochenodeoxycholic acid (GCDCA) were used as standard substances. Chloramphenicol was used as an internal standard., Die oben genannten Materialien wurden gekauft von Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Primäre Gallensäuren, einschließlich CA, CDCA, TCA, TCDCA, GCA und GCDCA, und sekundäre Gallensäuren, einschließlich DCA, LCA, UDCA, TLCA, TDCA und GDCA, in Galle und Kot wurden durch die Retentionszeiten bestimmt.

Quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR)

Proben aus Dünndarmgewebe (ca. 100 mg) wurden mit eiskaltem PBS gewaschen und homogenisiert. Die gesamte RNA aus Geweben und Zellen wurde mit dem Trizol-Reagenz isoliert (Omega Bio-Tek, Norcross, USA, Nr. R6812). Primer wurden mit Primer Express 3 entwickelt.,0 software basierend auf den mRNA-Sequenzen aus einer Datenbank (Tabelle 3) und synthetisiert durch Invitrogen (Peking, China). Methoden zur RNA-Extraktion und quantitativen Echtzeit-PCR (qRT-PCR) sind in unseren bisherigen Publikationen beschrieben. qRT-PCR wurde mit einem einstufigen SYBR® PrimeScript® RT-PCR Kit (Takara Biotechnology Co., Ltd., Dalian, China). Die Amplifikation wurde durchgeführt unter Verwendung eines BIO-RAD iCycler Thermal Cycler (BIO-RAD, Hercules, CA, USA). Die relativen mRNA-Expressionswerte wurden unter Verwendung der Ct-Methode (Comparative Critical Threshold) (in einer separaten Röhre) bestimmt., Das zweite Gen β-Aktin wurde als Kontrolle für die Normalisierung verwendet.

Western blot assay

Western blot Analysen von Dünndarmgewebe und kultivierten Zellen wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt . Äquivalente Proteinmengen aus jeder Probe wurden unter Verwendung von SDS-PAGE (12% Gele) hergestellt und getrennt, gefolgt von einem Elektrotransfer zu PVDF-Membranen., Membranen wurden mit Blockierungslösung (Tris-gepufferte Kochsalzlösung, 8% fettfreie Trockenmilch) für 2 h inkubiert, gefolgt von einer Inkubation mit spezifischen Antikörpern bei 4 °C über Nacht. Membranen wurden ausgiebig in TBST gewaschen (Tris-gepufferte Kochsalzlösung mit Tween, die 0,5% Tween-20 in TBS enthielt) und mit Meerrettichperoxidase-konjugierten sekundären Antikörpern in TBST für 1 h inkubiert. – Blot, densitometrie wurde durchgeführt, und die bands wurden analysiert mit ImageJ-software., Antikörper, die auf den apikalen natriumabhängigen Gallensäuretransporter (ASBT), das ileale Gallensäurebindungsprotein (I-BABP) und den organischen gelösten Transporter α/β (Osta/β) abzielen, wurden von Abcam (Cambridge, UK) gekauft. Sekundäre Antikörper gegen Ziege IgG wurden von Sun Biomedical Technology Co. erhalten. (Beijing, China).

Immunfluoreszenz

Ileumgewebe, das mit 4% gepuffertem Paraformaldehyd fixiert war, wurde in Paraffin eingebettet und 4 µm dicke Abschnitte wurden hergestellt. Abschnitte wurden deparaffinisiert und in 3% H2O2 für 15 min abgeschreckt, um endogene Peroxidase zu blockieren., Abschnitte wurden in PBS gewaschen und mit einem Anti-I-BABP-Antikörper in PBS (1:50 Verdünnung) für 1 h bei 37 °C inkubiert.Ein FITC-konjugierter (Fluoresceinisothiocyanat) Antikörper wurde bei einer 1:50 Verdünnung zugegeben und für 0,5 h bei 37 °C inkubiert. I-BABP wurde mit einem Fluoreszenzmikroskop (BX60, Olympus, Ina, Japan) abgebildet. I-BABP wurde als grüne Fluoreszenz beobachtet, und der Kern wurde als rote Fluoreszenz beobachtet .,

Caco-2-Zellkultur

Die Caco-2-Zelllinie wurde vom Cell Resource Center, Peking Union Medical College (dem Hauptsitz der nationalen Infrastruktur der Cell Line Resource) am Sept. 20, 2016. PCR und Kultur bestätigten, dass die Zelllinie frei von Mykoplasmenkontamination überprüft wurde. Der Artenursprung dieser Zellen wurde mittels PCR bestätigt. Die Identität der Zelllinie wurde mittels STR Profiling (FBI, CODIS) authentifiziert . Alle Ergebnisse sind auf der Website verfügbar (http://cellresource.cn)., Caco-2-Zellen wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle ‚ s Medium (DMEM) kultiviert, das 10% fetales Rinderserum (FBS), 1% Penicillin-Streptomycin und 1% nicht essentielle Aminosäuren enthielt. Caco-2-Zellen wurden bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre gehalten, die 5% CO2 und 95% Luft enthielt. Das medium wurde alle 2 Tage gewechselt. Die DMEM, FBS, 1% nicht essentielle Aminosäuren und andere Materialien wurden von der National Infrastructure of Cell Line Resource (Peking, China) oder Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) gekauft.,

Caprylsäure Durchlässigkeit assay durch Caco-2 cell monolayers

Für Gallensäure-Resorption Experimente, unter Bezugnahme auf den Bericht von Y. Wang, et al. , Zellen wurden ausgesät und 21 Tage lang auf millizellulären Zellkultureinsätzen (0,4 µm, Millipore, Molsheim, Frankreich) gezüchtet, um konfluente und hochdifferenzierte Zellmonoschichten zu erhalten. Die Bildung funktioneller epithelialer Monolagen wurde vor Experimenten mittels Messung des transepithelialen elektrischen Widerstands (TEER) mit einem Millizellenmeter (Millipore) überwacht., Die Zellmorphologie wurde unter Verwendung eines Elektronenmikroskops beobachtet, und die Permeabilität wurde unter Verwendung von Lucifer Yellow (Sigma, MO, USA) als Marker bestimmt.

Die Herstellung von Fettsäuren und CA wurde wie von X. Zhang, et al. . Fettsäuren und CA wurden gemessen und in Ethanol gelöst, dann mit Zellkulturmedium mit 20 mg/L endotoxinfreiem BSA auf eine Endkonzentration von 50, 100 oder 200 µmol/l verdünnt (Ethanol< 0,1%). Die gelösten Fettsäuren und CA wurden in einem Wasserbad bei 37 °C für 1 h vor Zugabe zu den Zellen inkubiert., Caprylsäure (C8:0), Caprinsäure (C10:0), Stearinsäure (C18:0) und Ölsäure (C18:1) wurden von Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) gekauft.

Die apikalen (AP) und basolateralen (BL) Seiten der Monoschicht wurden mit Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) gewaschen und in serumfreiem Gesamtmedium für 15 min ausgeglichen. Das Medium im AP wurde durch frisches Medium-haltiges CA (200 µmmol/L) ersetzt oder mit einer der Fettsäuren (C8:0, C10:0, C18:0 oder C18:1) bei 50, 100 oder 200 µmol / L gemischt., Die Zelllebensfähigkeit von Caco-2-Zellen unter verschiedenen Bedingungen wurde durch den WST-1-Zellzytotoxizitätstest (Abb. 1). Das Medium mit einer der Fettsäuren wurde als „C8:0, C10:0, C18:0 oder C18:1 Gruppe“definiert. Die “ Kontrollgruppe „enthielt keine Fettsäuren, und der“ Kontrollgruppe “ fehlten CA und Fettsäuren. In der BL wurde nur frisches Medium verwendet. Die Medien von der AP-und BL-Seite wurden 2 h später entfernt und für CA-Analysen mittels HPLC-MS gelagert., Die scheinbare Permeabilität (Papp) wurde unter Verwendung der folgenden Gleichung berechnet: Papp = dQ/dt× 1/C0A (dQ ist das zusammengesetzte Aussehen im Empfängerfach, dt ist die Zeit, C0 ist die Konzentration im Spenderfach und A ist die Oberfläche des Einsatzes).

I-BABP expression in Caco-2-Zellen

Caco-2-Zellen wurden ausgesät in eine 6-well-Platte (Corning, NY, USA) und kultiviert, um insgesamt Zusammenfluss mit hoher Differenzierung, um zu bestätigen die Effekte von MCFAs auf der I-BABP . Das Kulturmedium wurde vor Experimenten mit einem Medium, das delipidisiertes FBS für 24 h enthielt, ersetzt., Die Zellen wurden mit eiskalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und mit frischem Medium inkubiert, das CA bei 200 µmol/L (definiert als CA-Gruppe) oder CA mit einer der Fettsäuren (C8:0, C10:0, C18:0 oder C18:1) bei 200 µmol/L (definiert als „C8:0+CA, C10:0+CA, C18:0+CA oder C18:1+CA-Gruppe“) oder C8:0 oder C10:0 bei 200 µmol/L (definiert als CA-Gruppe) oder (definiert als „C8:0-Gruppe und C10:0-Gruppe“) für 24 h. Und die leere Gruppe war ohne Fettsäuren und CA. Das Medium wurde entfernt und die Zellen wurden dreimal mit eiskaltem PBS gewaschen., Die gesamte RNA und das Protein wurden isoliert und für weitere Analysen der I-BABP-mRNA und der Proteinexpressionsniveaus gesammelt.

Statistische Analyse

Alle Daten werden als Mittelwert ± SD ausgedrückt. Die Daten wurden unter Verwendung einer Einweganalyse der Varianz analysiert, gefolgt vom unabhängigen T-Test, um die Signifikanz der Differenz zwischen Gruppen mithilfe der SPSS-Softwareversion 17.0 zu bestimmen. P < 0.05 wurde als statistisch signifikant.